茶黃色素

茶黃色素最早由Roberts發現，指紅茶中溶於乙酸乙酯呈橙黃色的物質，由多酚類及其衍生物氧化縮合而來，紅茶中茶黃素類的含量一般為0.3%～1.5%，對紅茶的色香味及品質起着決定性的作用。近年來，由於茶黃色素具有多種與人體健康有關的潛在功能，如抗氧化、防治心血管疾病、降血脂、抗癌防癌等，因而受到國內外的廣泛關注，成為茶葉品質化學與功能成分的研究熱點。

茶黃色素以多酚類物質、兒茶素為主要成分，還含有氨基酸、維生索C、維生素E、維生素A原、黃酮及黃酮醇等。茶黃素是茶色素的主要成分，共有12種組分，其中茶黃素、茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯和茶黃素-3’-沒食子酸酯是4種最主要的茶黃素。在茶葉加工中主要由簡單兒茶素和沒食子兒茶素配對氧化縮合而成。茶黃素類的發現與紅茶發酵過程的研究密切相關。 ^[1] 

茶黃素是一類具有苯並卓酚酮結構化合物的總稱，其中茶黃素（theaflavin，TF₁）、茶黃素-3-沒食子酸酯（theaflavin-3-gallate，TF₂A）、茶黃素-3´-沒食子酸酯（theaflavin-3´-gallate，TF₂B）和茶黃素雙沒食子酸酯（theaflavin-3，3′-digallate，TF₃）是4種主要的茶黃素。 ^[2] 

茶黃素的紅外光譜表明所有茶黃素的最大吸收都出現在380nm和460nm。茶黃色素純物呈橙黃色針狀結晶，熔點237～240℃，易溶於水、甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇和乙酸乙酯，難溶於乙醚，不溶於三氯甲烷和苯。茶黃色素溶液呈鮮明的橙黃色，水溶液呈弱酸性，pH約5.7，在pH4.6-7.0範圍內色澤較好，顏色不受茶提取液pH影響，但在鹼性溶液中有自動氧化的傾向，且隨pH的增加而加強。茶黃色素具有抗氧化性，其抗氧化性可與維生素C、BHA、BHT相比。

Roberts E A H對紅茶發酵縮合形成的產物的組成進行了大量的研究，發現了茶黃素、茶紅素的存在並用純化的兒茶素進行模擬實驗，結果表明：(-)表沒食子兒茶素（L-EGC）與(-)表沒食子兒茶素沒食子酸酯（L-EGCG）是紅茶發酵時進行縮合的主要物質並提出了茶發酵過程中色素形成的模式；還從紅茶中分離出茶黃素和茶黃素沒食子酸酯利用紙層析、光譜分析等方法，確認茶黃素是L-EGC和L-EGCG的二聚合產物。潼野慶則等在Ro-berts E A H研究的基礎上對茶葉中的兒茶素的氧化產物的形成進行了大量的研究，證實了具有連苯三酚基的兒茶素（L-EGC和L-EGCG）氧化後發生聚合，均比不具有連苯三酚基的兒茶素（L-ECG和L-EC）減少快，經過分析確定了茶黃素形成途徑。Sanderson G W經過實驗證明了Roberts的研究並提出了紅茶發酵中兒茶素的反應途徑。

西崗五夫研究提出了多酚氧化聚合的3條途徑，進一步證實了Roberts和Sanderson關於紅茶在酶促條件下兒茶素的變化途徑，並指出紅茶發酵中不僅L-EGC和L-EGCG可以形成茶黃素，其他兒茶素和沒食子酸酯也可以形成茶黃素及其沒食子酸酯。

綜上所述，茶黃素化合物是成對的兒茶素經過多酚氧化酶催化氧化成鄰醌，B環上具有三鄰位羥基的兒茶素（如L-EGC和L-EGCG）被氧化後的鄰醌易縮合形成二苯基型二聚物，不能形成茶黃素，而B環上有兩個鄰位羥基（如L-EC‚L-ECG）與B環上有三個鄰位羥基的兒茶素共同存在時，它們氧化後的鄰醌可以通過B環之間偶聯形成茶黃素。 ^[2] 

1.1 Collier法樣品用熱水浸提，浸提液過濾、濃縮、冷凍乾燥，所得的水提取液用甲醇、水溶解，再用三氯甲烷萃取除去咖啡鹼等雜質。水相減壓濃縮除去甲醇和三氯甲烷，然後用乙酸乙酯反覆萃取，萃取液用硫酸鎂脱水，蒸餾至幹，得到茶黃素粗提物。該方法工藝技術比較簡單，但有機溶劑用量多。

1.2Ullah法用適量的磷酸二氫鈉與乙酸乙酯混合萃取，茶紅素能固定在水相中，而茶黃素留在有機相中。樣品用水浸提，過濾，濾液減壓濃縮，三氯甲烷萃取，除去咖啡鹼等雜質，然後用磷酸二氫鈉和乙酸乙酯混合萃取乙酸乙酯層經減壓濃縮乾燥，得茶黃素粗物。 ^[2] 

從紅茶中製備茶黃素產品存在着得率少，純度低以及分離純化困難等缺點。近年來，隨着對茶黃素形成機理的認識越來越深入，在製取茶黃素的方法研究已經取得了很大的進展，兒茶素模擬氧化就是一種行之有效的方法，模擬氧化按催化劑的不同分為酶促氧化和化學氧化兩種。酶促氧化是利用茶葉本身的多酚氧化酶（PPO）或過氧化物酶（POD）的氧化特性生產茶黃素；化學氧化主要是利用無機氧化劑氧化兒茶素製得茶黃素。常用的化學氧化劑有K₃Fe(CN)₆，FeCl₃，CuSO₄，Ag₂O，PbO₂，MgO₂等。

李立祥等利用酸性氧化劑在雙液相下氧化茶多酚製備茶黃素；張建勇等選取Fe₂(SO₄)₃,FeCl₃,Fe(NO₃)₃3種化合物為氧化劑酸性氧化茶多酚製備茶黃素,當酸性氧化劑質量濃度為40mg/mL時,茶黃素生成量最高。

Coxon D T等、Collier D P等採用化學氧化（均系K₃Fe(CN)₆/NaHCO₃為氧化劑）先後發現了TF、TFMD、TFDG、異茶黃酸、表茶黃酸、表茶黃酸沒食子酸酯等。

屠幼英等利用響應面分析法探討了固定化多酚氧化酶酶膜催化兒茶素生產茶黃素的最佳反應條件，確定了酶膜法生產高純度茶黃素的5個因素（反應時間、酶與底物之比、通氣量、底物濃度和pH值）及其最佳組合。

王坤波等利用梨果實多酚氧化酶，研究了兒茶素組成以及温度，pH值和底物濃度等因素對茶黃素酶催化合成的影響，並對梨多酚氧化酶的同工酶組成進行了研究。谷記平等選用分別來自茶鮮葉、梨和蘋果的多酚氧化酶在pH4∙8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液單相體系和由pH4∙8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液單相體系與乙酸乙酯組成的雙相體系中，對茶多酚進行酶催化反應制備茶黃素。

李適等從毛栓菌中分離得到的多酚氧化酶（PPO）用於茶黃素的體外氧化製備，將毛栓菌PPO加入到兒茶素反應液中進行雙液相反應，可得到10.19％的茶黃素，與茶鮮葉來源的PPO相比，毛栓菌PPO製備茶黃素的總含量偏低，但其中茶黃素-3-沒食子酸酯的比例較高，達到總茶黃素的68.10％，佔脂型茶黃素總量的92％。

Bonnely S等利用模擬氧化體系對紅茶加工過程氧化產物進行研究。茶葉本身的內源性酶作為模擬體系的酶，除去未加工的茶葉中多酚類物質和咖啡鹼可以獲得未被破壞的多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）。將固定化的酶作用於茶葉中的黃烷醇，通過高效液相色譜檢測發現‚有不同的茶黃素生成，而黃烷醇未能檢測到，利用¹H-NMR對模擬體系的生成物和紅茶進行對比發現兩者類似，因此模擬氧化體系可以成功模擬茶葉加工過程化學成分的變化

Itoh N等用漆酶（EC1.10.3.2）催化氧化綠茶提取物與沒食子酸的混合物，用來提高綠茶粗提物作為食品原料的功能性。採用溶劑提取和柱分離對反應產物進行分離純化，通過HPLC，¹H-NMR/¹³C-NMR,MALDI-TOF MS和UV分析檢測鑑定了epitheaflagallin和epitheaflagallin-3-O-gallate兩種產物。

茶黃素是一類具有苯並卓酚酮結構的化合物的總稱，因其分子式、相對分子質量各不同，因此很難測定茶黃素的各個組分，同時，茶黃素又很難與茶紅素及其它物質完全分離。以下對茶黃素測定方法進行了概述。

Roberts法是根據茶黃素和一部分茶紅素（TRsⅠ型）溶解於乙酸乙酯或4-甲基-戊酮（IB-MK），這部分可利用其能溶於碳酸氫鈉溶液而分離，茶紅素（TRsⅡ型）留在水層。

該方法存在重複性差、測定含量值偏低的缺點，但其方法簡單、試劑價格便宜且同時測定茶紅素的含量，因此被廣泛採用。

Hiton提出的一種快速測定方法。根據茶黃素分子中的苯並卓酚酮核可以與Flavognost試劑產生特異性反應，產生綠色絡合物，測定其吸光值換算成茶黃素含量。與Roberts法相比，該方法具有較好的重現性，已被Ellis推薦為國際紅茶最低質量標準的檢測方法。但該法受到提取液、提取温度、水的pH值等因素的影響，Flavognost試劑僅與茶黃素順式上的兩個羥基結合,使測定結果偏低,同時Flavognost試劑不易購得。

Likoleche-Nkhoma J W等用AlCl3代替Flavognost試劑，鋁鹽與茶黃素複合產生紅色，于波長525nm具有最大吸收，根據吸光值折算成茶黃素含量。該方法的測定值與Flavognost方法測定結構沒有顯著差異，且鋁鹽的價格較便宜，但樣品中加入過量的鋁鹽會產生渾濁。

Sephadex LH-20柱層析法（Column Chromatog-raphy，CC）法是竹尾忠一提出的。該方法能有效地分離茶黃素，而且對茶黃素的主要組分能定量，但操作複雜。

Whitehead D L等利用色素極性大小差異，提出的一種快速測定茶黃素總量的方法，該方法適於實驗室和工廠的常規檢測，但測量值偏高。

Bailey R G等使用光電二級管列檢測器的反相HPLC研究紅茶溶出物的性質，4種茶黃素能夠得到分離純化，提出了HPLC法測定茶黃素主要組分及其它物質的方法。HPLC法更精確，並能使各茶黃素單體得到較理想的分離。但該法需要高純度的茶黃素標樣。

Bee B L等首次採用毛細管電泳（Capillary Electrophoresis，CE）測定兒茶素類化合物和茶黃素類化合物。Wright L P等用非水相毛細管電泳測定紅茶中的4種主要茶黃素，並對有機溶劑的組成和電解質濃度對分離效果的影響進行了研究，確定了最佳的分離溶劑組成為V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（乙酸）＝71∶25∶4和90mmol/L的醋酸銨,10min內實現了茶黃素的基線分離,與常規毛細管電泳相比具有顯著的優勢。

高速逆流色譜法（High Speed CountercurrentChromatography,HSCCC）可避免樣品與固體載體的化學反應和死吸附等缺點,每次分離樣品結束後，管道中的殘留溶劑均可以衝出,不會對後續分離產生任何影響,因此高速逆流色譜法分離樣品具有高的回收率。

總之,茶黃素的分析測定方法各有利弊，可以根據具體情況選擇一種切實可行的分析方法。

Roberts E A H首先應用雙向紙層析發現茶黃素，已經進行了許多茶黃素的提取和分離純化的研究。Crispin D J等用Sephadex LH-20柱層析，採用丙酮梯度洗脱分離紅茶中的茶黃素，分離出3個峯，達到分離純化的效果。竹尾忠一應用Sephadex LH-20將紅茶水浸出物進行柱層析分離，以體積分數30％、40％、50％的丙酮順序梯度洗脱，茶黃素和其他色素達到有效分離。CollierP．D等應用兩種方法，即Sephadex LH-20柱色譜＋硅膠柱色譜和Sephadex LH-20柱色譜，均分離出5種茶黃素組分。

丁陽平等利用聚酰胺分離茶黃素，最佳分離條件為：上樣質量分數為500mg/50dL聚酰胺，上樣質量分數為20％，洗脱劑為甲醇∶氯仿∶丙酮∶冰醋酸（體積比為3∶5∶8∶0.5），採用等度洗脱，流速為0.6BV/h，分離得到茶黃素和茶黃素-3´-沒食子酸酯兩組分，含量分別為93％和85％。

Wang K B等用聚酰胺薄板採用不同的展開劑實現了兒茶素（DL-C），‚表兒茶素（EC），表沒食子兒茶素（EGC），表兒茶素沒食子酸酯（ECG），表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG），茶黃素（TF₁）、茶黃素-3-沒食子酸酯（TF₂A）、茶黃素-3´-沒食子酸酯（TF₂B）和茶黃素雙沒食子酸酯（TF₃）9種成分的有效分離。

Yanagida A等用高速逆流色譜（HSCCC）對茶葉中的兒茶素和食品相關的多酚進行了分離分析，溶劑體系為叔丁醇-乙酸乙酯-乙腈和三氯乙酸，以上相有機溶劑為流動相，下相為固定相，流速為2mL/min。結果表明單聚合兒茶素以及它們的沒食子酸酯和咖啡鹼為半發酵綠茶中的主要成分。此外，疏水性的茶黃素和極性的茶紅素也被檢測分離出。

Wang K等用高速逆流色譜分離純化茶黃素和兒茶素，採用V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）∶V（水）∶V（乙酸）＝1∶5∶1∶5∶0.25溶劑體系，下相為流動相，流量為2mL/min‚轉速為700r/min，可以從紅茶或茶黃素粗提取物中成功分離4種主要的茶黃素單體，用相同的溶劑體系也可以將表沒食子兒茶素沒食子酸酯，沒食子兒茶素沒食子酸酯，表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素從綠茶中成功分離。

Yang C等用高速逆流色譜和Sephadex LH-20相結合對紅茶中的主要茶黃素進行分離純化，採用∶V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）∶V（水）＝1∶3∶1∶6溶劑體系，利用高速逆流色譜可以成功分離出茶黃素（theaflavin‚TF₁）、茶黃素-3-沒食子酸酯（theaflavin-3-gallate TF₂A）、茶黃素-3´-沒食子酸酯（theaflavin-3´-gallate TF₂B）和茶黃素雙沒食子酸酯（theaflavin-3，3´-digallate TF₃），但是TF₁中包含表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）；同樣地，單獨使用Sephadex LH-20能夠有效的分離TF₂A，TF₂B和TF₃，但EGCG中也混有TF₁。將高速逆流色譜和Sephadex LH-20相結合能夠很好分離紅茶中的4種主要茶黃素。綜上所述，隨着色譜技術的發展，高速逆流色譜有望成為茶黃素分離純化的有效途徑，與傳統的柱色譜相結合將達到更好的分離效果。 ^[2] 

茶黃素具有很強的生理活性，有抗氧化、防癌抗癌、降血脂、預防心血管疾病、抗菌抗病毒等生理功能，甚至在某些方面的藥效比兒茶素還要強。

茶葉具有防癌、抗癌作用，主要有效成分為茶多酚、兒茶素單體和茶色素。現代藥理學活性研究表明，茶黃素具有抗突變、抑制細胞色素P450的活性、抑制癌細胞的胞外信號和增殖、抗炎和癌症的化學預防作用等。據文獻報道，茶色素具有比茶多酚更強的抗氧化性能和良好的醫藥保健功能，如預防心腦血管疾病、預防齲齒、防癌抗癌、抗菌抗病毒等。近年來，有不少研究用TF-3-G，TFDG和TF-3’-G等茶黃素單體對人體纖維肉瘤HT1080、巨嗜細胞、鼠肺細胞等進行抑制作用的研究，並且與茶多酚作用效果進行了比較，對機理進行探討。但是由於茶黃素單體的分離非常複雜，並且獲得的量較少，對於研究工作帶來許多困難。有學者採用高速逆流色譜技術分離了茶黃色單體，為獲得較大量的茶黃素單體提供了方便，並且對人胃癌細胞株MKN-28、人肝癌細胞株BEL-7402和人急性早幼粒白血病細胞株HL-60的生長抑制進行了生活物活性研究。結果表明，3種茶黃素都表現出一定程度的抑制人肝癌細胞和人胃癌細胞存活作用，而且呈明顯的劑量依賴關係。茶黃素雙沒食子酸酯具有良好的抑制 H1299細胞生長的活性，IC50 為25 μmol/L，有調節細胞週期的活性，可增加HCT-1l6細胞G1期細胞的比例，有促進HCT-ll6細胞凋亡的作用，濃度為50 μmol/L 時效果顯著，48 h凋亡率達到40%以上。Western雜交技術分析結果表明，它可降低HCT-ll6細胞中促癌蛋白質因子Bc1-xL的表達量，可增加抑癌蛋白質因子Bax的表達量。

茶黃素通過調節體內的生物酶系的活性、直接消除自由基、與金屬離子絡合、以及防止低密度脂蛋白的氧化等途徑來實現它的抗氧化作用。

谷胱甘肽S轉移酶GST可以催化親核性的谷胱甘肽與各種親電子外源化合物的結合反應。許多外源化合物在生物轉化第一相反應中極易形成某些生物活性中間產物，它們可與重要的細胞生物大分子發生共價結合，對機體造成損害。谷胱甘肽與其結合後，可防止發生此種共價結合，起到解毒作用。谷胱甘肽可在谷胱甘肽過氧化物酶的作用下從H2O2處接受電子，發生自身氧化，從而阻斷羥基自由基的生成。用茶黃素餵養小鼠後，將其暴露於致癌物二甲基苄蒽DMBA中，結果表明茶黃素均能明顯激活小鼠體內的GST、GPX的活性，同時還伴隨着脂質過氧化的顯著降低。黃嘌呤氧化酶在催化次黃嘌呤轉變為黃嘌呤，並進而催化黃嘌呤轉變為尿酸的兩步反應中，都同時以分子氧為電子接受體，從而產生大量的O-2和H2O2，後者再在金屬離子參與下形成羥基自由基。茶黃素能抑制黃嘌呤氧化酶產生尿酸並且清除過氧化物。在HL-60細胞中，TF3能抑制肉豆寇沸波酯PMA誘導的過氧化物的產生。對H2O2的清除能力則TF2>TF3>TFl>EGCG。CYP1A1是一類主要參與代謝活化多環芳烴類化學致癌物的I相酶，具有芳香烴羥化酶活性。多環芳烴是環境中，特別是香煙煙霧中最重要且危害深廣的一類致癌物，其在體內活化過程主要由CYP1A1催化完成，在這一反應過程中，同時產生對身體有害的自由基。茶黃素能夠抑制在人HepG2細胞中由奧美拉唑OPZ誘導的CYP1A1的活性。紅茶多酚能夠抑制NADPH氧化酶的兩個亞單位p22phox 和p67phox，同時上調了過氧化氫酶的活性，從而減少活性氧的產生。

炎症的發生由炎症介質介導而成，其中主要的炎症介質是前列腺素PG。PG是由花四烯酸經環氧合酶催化而成。經研究已分離鑑定的環氧合酶有兩種：COX-1和COX-2。COX-1為人體內固有酶，也稱結構酶，機體各組織均能表達，在許多正常生理過程中發揮作用，例如，維持正常胃粘膜、影響腎血流和血小板凝聚等；而COX-2為誘生酶，在急性炎性應答反應中，由細胞因子、生長因子和細菌內毒素等誘導炎症細胞合成。TFS能特異性地抑制 COX-2 基因表達，IC50值為 20-40 μmol。通過RT-PCR發現，TF對COX-1沒有抑制作用，從而消除非菌類抗炎藥NSAIDs對COX-1的抑制所引起的胃腸道毒性等副作用。茶色素能減少內原性尿酸的生成，減少痛風關節炎的發作，並且在某些方面優於丙磺舒、別嘌呤醇。

Toda M等證實了茶黃素對金黃色葡萄球菌有抑制作用。Yam T S等也證實了紅茶中的茶黃素有很好的抑菌性能。

Taguri T等研究了10種植物多酚［epigal-locatechin（1）‚epigallocatechin-3-O-gallate（2），pu-nicalagin（3），tannic acid（4）,castalagin（5），pro-delphinidin（6），geraniin（7），procyanidins（8）,茶黃素（9）和用枇杷多酚氧化酶處理的茶多酚（10）］對食物中致病細菌（金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌和弧菌）的抑制作用。結果表明1，2，5和6種多酚具有相對低的最小抑菌濃度。

Friedman M等對7種兒茶素單體，4種主要茶黃素和各種茶的水粗提物對蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果進行了研究，結果表明：茶的抑菌效果主要取決於茶葉中的兒茶素和茶黃素，且抑菌效果超過了藥用抗生素如四環素和萬古黴素。

1mm濃度紅茶提取物可抑制流感病毒A和流感病毒B對腎MDCK細胞的侵染，其機理是抑制病毒吸附在細胞上而不是抑制病毒在細胞中的複製。另外還發現TF-3具有抑制猴腎MA104細胞系對輪狀病毒和腸病毒的感染作用，TFs可使牛狀病毒和冠狀病毒的侵染失效，80mg/ml紅茶提取液可完全抑制人輪狀病毒。TFs不僅能抑制HIV-1逆轉錄病毒的逆轉錄酶的活性，還能抑制各種細胞中DNA和RNA聚合酶的活性。進一步研究表明，它對逆轉錄酶和細胞DNA聚合酶的抑制方式是和模板引物相競爭，而與核甘酸底物無競爭作用。 ^[2] 

Chen C N等研究表明茶黃素雙沒食子酸酯可抑止SARS病毒。

TFs抗心血管疾病是當今較為新型的研究領域。其機理是建立在血液流變學的基礎上。基礎研究和臨牀試驗表明，TFs有顯著抗凝、促纖溶、防止血小板粘附和聚集的作用，能顯著降低高脂動物血清中三酸甘油酯GT，機制是通過改善紅細胞變形性、調整紅細胞聚集性及血小板的粘附聚集性，降低血漿粘度，改善微循環，保障組織血液和氧的供應，提高機體整體免疫力和組織代謝水平，達到防病和治病的目的，能顯著降低高脂動物血清中三酸甘油酣、低密度脂蛋白LDL，提高高密度脂蛋白HDL。TFs對血管緊張素I轉換酶具有顯著抑制效應，降血效果好。

臭氣的種類很多，主要包括甲硫醇、氨氣、硫化氫和甲苯等化合物，日本MiikUi將兒茶素添加到口香糖中，經咀嚼後採集唾液，體外測定甲硫醇的含量，結果表明，兒茶素對口臭的抑制能力大於葉綠素鈉，咀嚼含兒茶素的口香糖，口腔中的甲硫醇含量顯著下降，其中Eocg效果最好。龔雨順，黃建安，劉仲華等就茶葉功能成份對主要惡臭成分甲硫醇的去除效果進行了研究，結果表明：綠茶水提取物，兒茶素，EGCG對甲硫醇的去除效果不明顯，而茶黃素則表現出較強的活性；在PH10的鹼性條件下，1 mg含量為40%的茶黃素對甲硫醇的最大去除量為 0.232 mg。綠茶水提物、70%的兒茶素和EGCG的體外試驗對甲硫醇沒有去除能力，其作用機理可能是兒茶素具有較強的抑菌效果，可以抑制口腔中的微生物生長繁殖，從而減少甲硫醇的生成，而茶黃素有直接清除甲硫醇效果。