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濃縮膠
鎖定
- 中文名
- 濃縮膠
- 英 文
- SDS-PAGE
- 用 途
- 蛋白質/寡核苷酸的分離
- 製作方法
- 聚丙烯酰氨凝膠電泳
- 注
- 分離膠30Ml,濃縮膠10Ml
濃縮膠作用
濃縮膠的作用是有堆積作用,凝膠濃度較小,孔徑較大,把較稀的樣品加在濃縮膠上,經過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區帶。當樣品液和濃縮膠選pH6.8的TRIS/HCL緩衝液,電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始後,HCL解離成氯離子,甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷,因此一起向正極移動,其中氯離子最快,甘氨酸根離子最慢,蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大,超過蛋白,因此在後面形成低電導區,而電場強度與低電導區成反比,因而產生較高的電場強度,使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動,形成以穩定的界面,使蛋白聚集在移動界面附近,濃縮成一中間層。大大提高了電泳的靈敏度。
濃縮膠配製方法
一般同工酶可選擇7?5%~10%的膠(過氧化物酶和酯酶7?5%較合適,超氧化物歧化酶用10%,可溶性蛋白可根據需要配製)。將配製好的凝膠液置真空乾燥器中,抽氣10Min,再加入TEMED15μl;混勻後用一細玻棒引流,沿無凹槽的玻板緩緩注入膠室中,注膠過程要防止氣泡產生。膠液加到離凹槽3CM處為止,立即用注射器輕輕在膠溶液上面鋪1CM高的水層,但不要擾亂丙烯酰胺膠面。待分離膠和水層之間出現清晰的界面時,表示聚合已完成。用注射器小心吸出上層覆蓋水,按表5-1配製好濃縮膠,抽氣後加入5μlTEMED,混合後加到分離膠上層,插入預先選擇好的樣品梳,注意不要帶入氣泡。
濃縮膠配製表
類別分離膠濃縮膠
T%57.51012.51517.520330%Acr5.07.39.7512.3214.8817.420.011%Bis45.67.55.43.53.531分離膠緩衝液3.753.753.753.753.753.753.75-濃縮膠緩衝液-------2.5重蒸水17.0513.158.88.337.675.153.055.4310%AP0.20.20.20.20.20.20.20.07注:分離膠30Ml,濃縮膠10Ml,可根據需要,按比例增減各成分的體積。
濃縮膠操作過程
.樣品製備採小麥幼苗上數第一展開葉,取中部,除去葉脈,準確稱取1g,加入少量提樣緩衝液,置冰浴研磨勻漿後定容至5Ml,10000r/Min離心15Min,上清液為可溶性蛋白質的粗提液。取此液0?5Ml加入等體積樣品處理液,混勻後貯於冰箱備用。
(1)過氧化物酶染色稱取0?1g聯苯胺,加少量無水乙醇溶解,依次加入5Mol/LHAC10Ml,1?5Mol/LNAAC10Ml,H2O70Ml,最後加入3~5滴H2O2。將此顯色液傾入20CM培養皿中,待電泳凝膠片加入後不斷攪動,觀察各條帶顯色的先後,照相或用鉛筆畫出過氧化物酶同工酶譜。最後用7%醋酸固定(注意色帶在HAC溶液中容易退色,固定時間不宜過長),拍照或製成幹膠片保存結果。
(2)酯酶同工酶顯色 稱取50Mgα-醋酸萘酯,50Mgβ-醋酸萘酯,100Mg堅牢藍RR(或堅牢藍B),先用約5Ml丙酮溶解,再用0?1Mol/LPH5?0的磷酸緩衝液稀釋到150Ml,將膠板浸入100Ml此液中,室温下顯色約20Min,可看到桃紅色的磷酸酯酶同工酶區帶。棄去染色液,用蒸餾水漂洗,再用7%HAC固定。
(3)超氧化物歧化酶染色 染色液組成:氮藍四唑(NBT)25μMol/L;核黃素0?01%;50MMol/LPH7?8磷酸緩衝液(含1MMol/LEDTA)。染色時,將準備好的電泳膠板放入盛有80MlNBT溶液(根據膠板大小加減溶液用量)的培養皿中,浸泡15Min後,換核黃素溶液浸泡5Min;然後將膠板放入含有1MMol/LEDTA的PH7?8磷酸緩衝液中,在距膠板10CM高度用40W日光燈直射膠面,直至藍色背景上出現透明條帶為止。
(4)過氧化氫酶同工酶染色 染色液的組成:A液為3%H2O225Ml,0?1Mol/LPH7?0磷酸緩衝液5Ml,0?1Mol/LNA2S2O33?5Ml;B液為0?09Mol/LKI25Ml加蒸餾水25Ml。先將準備好的電泳膠板浸泡在A液中,室温下放置15Min,倒出A液,用蒸餾水徹底沖洗乾淨,加入B液,酶活性表現在藍色背景上的白色區帶。蒸餾水漂洗後用10%甘油固定。
(5)可溶性蛋白的染色稱取0?2g考馬斯亮藍R250,用少量無水乙醇溶解,用含有40%乙醇和7%醋酸的水溶液稀釋至200Ml。將膠板浸入此液室温下染色5~6H,倒去染色液,用水沖洗附着於膠面的染料,再將膠浸入脱色液中(400Ml乙醇,70Ml冰醋酸加水到1000Ml)更換脱色液幾次,直到背景清晰為止。
幹膠製備:裁下2張比膠片四邊長3CM左右的玻璃紙在水中浸濕後,先將一張平鋪在玻璃板上,放上凝膠片,再蓋上另一張,用玻棒趕走氣泡,將玻璃紙邊緣折向玻板底部,用另一塊同樣大小的玻璃板壓住,再用夾子夾住兩端固定,室温下避光放置1天左右即可,然後取下幹膠,修剪整齊保存。
繪圖表示:將各酶帶按顏色深淺繪成譜帶圖。
濃縮膠附註
3?ACr和BIs的純化。精確的定量分析和製備電泳需要純度更高的ACr和BIs,其提純方法如下:
(2)BIs重結晶方法 將12gBIs溶於1000Ml40~50℃的丙酮中,趁熱過濾,濾液逐漸冷卻至20℃,用冷的布氏漏斗抽濾,收集結晶。用冷丙酮淋洗,真空乾燥。純BIs的熔點為185℃。