氨肽酶

氨肽酶種類繁多，將氨肽酶按照不同特性進行分類對人們認識和了解氨肽酶有着很大的幫助。關於氨肽酶的分類方式有許多種，如按底物特異性、按在細胞中所處的位置、按催化特性、按最適 pH 等進行分類，下面介紹主要的三種分類方式 ^[1]  ：

(1) 根據氨肽酶底物特異性的不同將氨肽酶分為兩大類：一類是具有嚴格的底物特異性的氨肽酶，它們只能特異性的水解某一種或一類氨基酸，例如，脯氨酸氨肽酶 PepX只能特異性水解 N 末端第二個氨基酸為 Pro 的肽段，而氨肽酶 A 只能特異性的水解N 末端第一個氨基酸是酸性氨基酸（天冬氨酸或者穀氨酸）的肽段；另一類氨肽酶具有較廣泛的底物譜，能水解大部分氨基酸，這一類氨肽酶一般會按照它們的最適反應底物進行命名，例如，亮氨酸氨肽酶對於 N 末端是亮氨酸的底物水解能力最高，同時它還能水解其它脂肪族疏水性氨基酸和鹼性氨基酸，而賴氨酸氨肽酶除了能有效地水解 N 末端為賴氨酸和精氨酸的肽段外還能水解其它一些脂肪族疏水性氨基酸。

(2) 根據氨肽酶催化方式的不同可將氨肽酶分為三類：金屬（metallo）、半胱氨酸（cysteine）、絲氨酸（serine）氨肽酶。大部分報道的氨肽酶都是金屬氨肽酶，約佔總數的 70%左右。常見的金屬離子有 Zn2+、Co2+、Mn2+等，一般金屬氨肽酶的活性中心含有 1-2 個金屬離子，在催化過程或者穩定蛋白質結構方面起着重要的作用。與金屬氨肽酶相反，半胱氨酸和絲氨酸氨肽酶催化過程中不需要金屬離子的輔助，其活性中心分別含有關鍵基團 Cys 和 Ser，催化肽鏈斷裂時起親核攻擊的作用，這兩類氨肽酶較為少見，各自所佔比例不到 20%。

(3) 根據氨肽酶最適反應 pH 的不同可將氨肽酶分為三類：酸性（Acidic）、中性（Neutral）和鹼性（Alkaline）氨肽酶。一般我們把最適 pH 為 2.0-6.0 的叫作酸性氨肽酶，pH為 6-8 的稱為中性氨肽酶，pH 為 8.5 以上的稱為鹼性氨肽酶。細菌來源的氨肽酶絕大部分屬於鹼性氨肽酶。氨肽酶的最適反應 pH 一般為 6-9，只有少數氨肽酶不在該範圍內。

(4)根據氨肽酶在細胞中的定位不同，有些氨肽酶存在於細胞質中，有些氨肽酶存在於某些革蘭氏陽性菌的細胞壁上，還有小部分的氨肽酶可以與膜結合 ^[2]  。

氨肽酶根據不同的標準有不同的分類，且這些分類相互交錯，相互聯繫，使得酶的分類更加的系統和完善。

氨肽酶作為一種蛋白酶，廣泛存在於不同物種的生物體中，包括哺乳動物、植物、微生物等。在動物體內，日本學者 Akihiro okitani 首次從兔子的骨骼肌中分離出一種具有氨肽酶活性的蛋白水解酶，並命名為“BANA hydrolase H”。在此之前，我國學者梅傳生等首次報道了一種植物來源的氨肽酶，並對該酶在水稻葉片衰老過程中的變化進行了研究。隨着人們對氨肽酶研究的深入，越來越多的動植物來源的氨肽酶陸續被報道。

由於動植物體內成分複雜、氨肽酶含量較低，導致提取成本較高。隨着酶製劑行業的快速發展，為滿足市場需求，利用微生物發酵法生產酶已成為當今的主流趨勢和研究熱點。1935 年，Johnson 等在對寄生麴黴所產的酶進行分析時首次在微生物中發現了氨肽酶。報道的產氨肽酶的微生物種類繁多，主要分為兩大類：一類是真核微生物，包括毛黴屬、青黴屬、麴黴屬、酵母科等；另一類是原核微生物，包括假單胞菌屬、乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、放線菌等 ^[1]  。

當蛋白質大分子酶解時，肽鏈中含有的疏水性氨基酸暴露出來，接觸味蕾，產生苦味。因此，用蛋白酶水解後的蛋白質水解液通常都呈現苦味。研究發現，疏水性氨基酸對苦味的形成是必須的，且這些疏水性氨基酸一般都位於肽鏈末端；如在肽鏈中殘留一定量的脯氨酸其苦味明顯增強。蛋白酶解液的脱苦方法的研究以前主要採用物理、化學方法，即分離提取苦味肽，或添加風味物質掩蓋苦味。有研究報道，利用氨肽酶進一步水解蛋白質的酶解液，可以脱除其苦味，1969 年 Y.Sato 等用 11 種蛋白酶處理酪蛋白水解液，發現亮氨酰氨肽酶可以脱去蛋白質酶解液的苦味，研究還發現各種乳酸菌的粗酶提取物均能夠除去或降低酶解液的苦味。此外，需要特別説明的是，脯氨肽酶在脱苦上有特別重要的作用，因為肽鏈末端脯氨酸殘基除去後，其三維結構會發生顯著改變，對酶解的敏感性增強，這種氨肽酶主要存在於乳酸菌中 ^[3]  。

與蛋白酶複合使用，可以大幅度提高蛋白質的水解度。在醬油釀造、乾酪生產及其它蛋白水解產品的製備過程中，可以提高蛋白質的利用率，節省成本。如崔春、趙謀明等利用風味蛋白酶（蛋白酶和氨肽酶的複合體）深度酶解藍園魚參蛋白，酶解 6h 後蛋白質的利用率即達到 83.3%，21h 時水解度達到59.7%。

生物活性多肽大部分是細胞生長因子，它們在體內含量極低，但生物活性極高，對多種細胞生理功能和代謝活動發揮着生物調節作用。具有保健和美容的功能。通過控制蛋白質的酶解來得到特定的活性肽是製備活性多肽的一種安全且高效的途徑。劉通訊等先用蛋白酶對大豆分離蛋白進行水解，然後再用氨肽酶進行水解，研究發現，產品中的多肽含量相對單一用蛋白酶水解約能提高 12%左右。

脯氨肽酶能有效清除神經毒性化學毒劑及有機磷農藥，既可用作醫學上的解毒劑，也可以用作環境消毒劑。亮氨酰氨肽酶等還可用作蛋白質序列測定的分子工具。

氨肽酶在自然界中分佈較廣泛，不同來源的氨肽酶在表達量和底物特異性上存在着較大的差別。有關動物組織和植物來源的氨肽酶的報道已屢見不鮮，但從動植物中提取氨肽酶步驟較複雜、成本較高，因此從動植物中提取相關氨肽酶一般主要用於酶學性質的表徵和相關疾病的診斷。與動植物產酶相比，微生物產酶量更高，提取步驟更簡單，生產成本更低，市場上的氨肽酶產品基本都是利用微生物發酵生產。

雖然產氨肽酶的微生物種類較多，但大多數菌種由於產酶能力低或者存在安全隱患等原因並不適合大規模生產氨肽酶。報道的能用於氨肽酶工業生產的野生菌種主要有麴黴菌、芽孢桿菌和乳酸菌。2003 年 Basten 等從 Aspergillus niger 中分離提純了一種新型苯丙氨酸氨肽酶，它能有效水解氨基末端為芳基側鏈的氨基酸殘基，其中以水解苯丙氨酸殘基能力最強。2004 年 Murai 等從温泉土壤中篩選到了一株能產脯氨酸氨肽酶的 Aneurinibacillus thermoaerophilus，該菌所產的氨肽酶與其它內切蛋白酶協同作用能有效降解富含脯氨酸的膠原蛋白質，在蛋白質加工和水解產物脱苦方面中有一定的應用潛力。雖然國際已有氨肽酶產品出售，但有關微生物發酵產氨肽酶的產量的報道卻比較少。台灣學者 Lin SJ 等人進行的 Aspergillus oryzae LL1 大罐發酵的研究結果顯示，在5 L、20 L、250 L、2000 L 發酵罐中發酵產氨肽酶的水平分別能達到 0.22、0.16、0.19、0.12 LAP·mL-1。有關商品酶的資料顯示，諾維信和天野公司生產的商品氨肽酶活性分別為 1200 LAP·g-1和 500 LAP·g-1。江南大學谷海先、趙光鰲等通過 N+注入誘變選育氨肽酶高產 A. oryzae，並對發酵條件進行了初步優化，使產酶水平提高了 77.5%。Junichiro 等將來源於地衣芽孢桿菌的氨肽酶在枯草芽孢桿菌表達體系中實現了分泌表達，其產量達到 9U·mL-1 ^[1]  。