基因槍

基因轉移技術是一種將外源基因以在體(in vivo)或離體(in vitro)的方式導入到靶細胞核內的技術, 屬於基因工程技術(亦稱重組DNA 技術)的一個重要組成部分。基因工程技術以分子生物學等學科發展為基礎, 使人類擁有了構造生物遺傳物質新組合的能力。

對在體方式而言, 基因轉移技術需要跨越細胞外和細胞內雙層障礙。細胞外的轉移過程中遇到的障礙有:DNA 在血漿中的降解、網狀內皮組織對於DNA的吸收、難以將DNA 定位到特定的器官、轉染為黏液所阻止等;細胞內的障礙包括:溶酶體對DNA 的降解作用、DNA胞漿的穩定性以及DNA向質粒的移位等。

基因槍技術等直接轉移方法是人們以物理方法來將基因轉移的方法 ^[1]  。

基因槍法是一種基因導入儀技術，它把遺傳物質或其他物質附着於高速微彈直接射入細胞、組織和細胞器，是目前國際上最先進的基因導入技術。氣體基因槍以壓縮氣體（氦或氮）轉換成的氣體衝擊波為動力，使氣體基因槍槍產生一種“冷”的氣體衝擊波進入轟擊室，因此可免遭由“熱”氣體衝擊波引起的細胞損傷。氣體基因槍可在廣泛的細胞型中得到瞬時的、穩定的和高效率的轉化作用。氣體基因槍有一個產生衝擊波的特殊結構，在恰當的氣壓範圍內從3.5MPa-10MPa，具有相應不同的可破裂膜，將包覆DNA的粒子穿越，射入在轟擊室底部的靶細胞中（最大靶直徑50mm）。基因槍適用於動植物、細胞培養物、胚胎、細菌及小型動物的轉基因。具有快速、簡便、安全、高效的特點。中科院遺傳所、北京大學、浙江大學、中國農業大學、西北農林科技大學等有關單位均採用該設備。

基因槍的歷史可以追溯到1987年。

第一代基因槍是台式基因槍，其中火藥型台式基因槍是基因槍中最原始的類型。最早的基因槍是由美國康奈爾大學Sanford於1987年與該校工程技術專家Wolf及Kallen合作研究出的一種基因轉移的新方法。該方法一經發明便在學界嶄露頭角，Klein等人於1987年最早應用基因槍進行洋葱表皮細胞的轉化，並獲得了成功。

基因槍自1987年誕生以來得到迅速發展。美國康乃爾大學自1988年先後申報了三個關於基因槍技術的專利（EP 0331 855A2，1988：US Patent Number 4，945，050 July 31，1990：US Patent Number 5，036，006 July 30，1991）。1987-1990年間，高壓放電、壓縮氣體驅動等各種基因槍相繼出現，並都在重複的實踐中得到改進和發展。McCabe於1988年將目的基因包於鎢粉上，電轟擊大豆莖尖分生組織，結果約有2%的組織通過器官發生途徑獲得再生植株，在子代中檢測到了外源基因。1989年氣動式基因槍轉化煙草等植物獲得成功，並且得到了瞬時表達。大麥的轉基因技術比起其他植物相對發展速度較慢，直到1989年，Kartha等人用大麥的細胞和組織進行培養，成功檢測到報告基因的瞬時表達。

1990年，美國杜邦公司(DuPont Company)推出首款商品基因槍PDS-1000系統。該儀器是一種“biolistic”台式基因槍,有關的工藝技術是從一個小型的Biolistics公司(負責人來自康乃爾大學)購買的。據康乃爾研究基金會副主席和大學專利及技術市場的負責人W.Haeussler説,向杜邦公司轉讓的這個技術是當時康乃爾發明的一次最大交易,將總數228萬美元的專利税和研究支持費一次性付給康乃爾大學。當時由伯樂公司(Bio-Rad Laboratories, Inc.)與杜邦簽署的的代工與分銷商協議。隨後，伯樂公司1992年推出了PDS-1000/He槍。國內中國科學院生物物理所和清華大學也分別於1989年和1991年推出了新的槍種並申請了專利（中國專利89109334和91207467）。與現在新型手持型基因槍不同，台式基因槍體積偏大，實驗場所受限，不能靈活應用於田間地頭。高壓氣體需要抽真空，壓縮機工作時噪音較大，而且過高氣壓推動微粒子轟擊使得台式基因槍僅限於細胞轉殖而不能用於活體轉殖。第一代基因槍的每槍轟擊成本也很高，金粉與控制氣壓用的Rapture disk均造價不菲。

第二代基因槍出現於1996年，伯樂公司推出了Helios手持式基因槍。這是歷史上最早出現的手持式基因槍。該系統通過可調節的氦氣脈衝，來帶動位於小塑料管內壁處預包有DNA、RNA 或其它生物材料的金粉顆粒，將其直接打入細胞內部。與第一代台式基因槍相比，Helios手持式基因槍摒棄了抽真空壓縮機，犧牲了一些氣體壓力，從而使活體動物轉殖成為可能，可以對活體動物的肌肉、皮膚直接進行轉殖。因其體積小巧，方便實驗人員隨身攜帶，大大地拓寬了基因槍的應用範圍。在隨後的10年裏，Helios手持式基因槍被廣泛應用於由原生質體再生植株較為困難和農桿菌感染不敏感的單子葉植物的基因轉殖。在基因槍以前，外源DNA進入細胞質後很難穿過雙層膜的細胞器。用基因槍技術轉化這類細胞器，轉化頻率高，重複性好，是目前該領域研究中最常用和最有效的DNA導入技術。相比較第一代台式基因槍而言，手持式基因槍由於氣體壓力較小（僅有100-600 psi），而不能穿透成熟葉片的細胞壁，一定程度上影響了其在植物中轉基因的應用範圍，不過與台式基因槍互補，Helios很好地延伸了基因槍的應用領域。

同樣是利用高壓氣體傳送基因，製作技術的改良使得基因槍從細胞轉殖到活體轉殖，從台式到手持，一步一步將基因槍的應用範圍擴大。首先意識到並積極嘗試利用基因槍的生命科學工作者在轉基因工作中的科研水平得到了極大提高，轉基因工作者的想象力也因此得到了解放。蒸蒸日上的基因槍技術被學界寄予厚望，視為轉基因領域的明日之星。不過慢慢地人們發現，活體動物的臟器相比於皮膚、肌肉要脆弱得多，如小鼠活體的肝和脾最多隻能承受40psi的壓力，在100psi的高壓氣體衝擊下器官會被嚴重破壞而導致實驗失敗。而過低的氣體壓力並不能令基因微載體具有足夠的動量打入細胞內部。氣體壓力與粒子傳遞速度的矛盾成了基因槍發展的瓶頸，這個問題在之後的10年一直困擾着各大生命科學儀器廠商的研發團隊。

直到2009年，Wealtec公司推出GDS-80低壓基因傳遞系統（又稱：GDS-80基因槍）（US Patent Number 6,436,709 B1），引領了第三代基因槍技術發展方向。GDS-80手持式基因槍巧妙地從流體動力學與航空動力學入手，使用氦氣或氮氣於低壓狀態加速生物分子至極高的速度，完成基因傳送，從一個全新的角度解決了氣壓與粒子速度的矛盾。第三代基因槍的超低壓（10-80 psi）推動，不僅沒有犧牲反而大大增加了微粒子的傳輸動量，因此不僅使基因槍能夠成功應用於僅在低壓狀態下才能完成的動物活體器官層面轉殖；而且相比較於第二代手持式基因槍，GDS-80射出的攜基因微粒子因為其本身的高動量，居然能夠像台式基因槍發射出的粒子一樣穿透植物細胞壁穿入植物細胞完成轉殖，而在此之前，完成這一工作的第一代台式基因槍需要至少1000-2000psi的高壓氣體。在動物細胞，尤其是活體動物轉殖實驗中，本身具備高動量的生物粒子毋需藉由微粒子載體(如金粒子)的攜附方式轉移至目標體中，這在避免了靶細胞內異物殘留問題的同時，大大降低了實驗成本。第三代基因槍的低壓傳導，使得細胞損害與槍體轟擊的噪音都大大減少，並有效地在動物實驗中降低了由金粉微載體帶來的昂貴開銷。GDS-80基因槍“子彈”的製備也從乾式轉為濕式，節省了烘乾的時間，簡化了流程。

1.基因轉殖於目標細胞，組織，器官或活體

2.基因功能短暫表現之研究

3.功能穩定性表現之研究

4.遺傳或癌症相關之研究

5.DNA疫苗的研究與應用

6.基因治療相關之研究

7.基因轉殖植物之研究

8.基因工程或藥物相關研究

在迄今發展起來的棉花轉基因技術中，農桿菌介導的遺傳轉化應用最為廣泛。自1987年Umbeck等通過農桿菌介導法成功獲得坷字棉轉基因植株後，農桿菌介導法逐漸成為國際上最普遍的轉化手段，並且取得很大進展。中國農科院棉花研究所成功建立了20多個棉花品種的高效、穩定的規模化轉化體系，實現了流水線操作，建立了高效、工廠化的棉花轉基因技術體系。儘管農桿菌介導法是理論和實踐都較為完善的一種轉化技術，且已被廣泛用於雙子葉植物的轉化，但該方法受宿主基因型範圍的限制，很多優良品種(系)很難以此法進行轉化，並且轉化程序煩瑣複雜。花粉管通道轉化法雖然沒有基因型、種屬控制，但其轉化技術不太完善，對轉化機制缺乏系統的研究，常侷限於開花期才能應用。因此，需要發展出有效的基因轉化方法。

中國農業科學院棉花研究所葉武威等人在2013年開發出一種棉花的基因槍活體快速轉化方法，通過第三代便攜式基因槍和優化轉化的參數使活體轉化時對花蕾和花粉形成微創傷，大大縮短了獲得轉基因植株的週期。該方法包括如下步驟:(1)利用基因槍轟擊的方法，將含有外源基因的載體轟入父本棉花的花粉中;(2)將基因槍轟擊後的父本花粉授粉到活體母本棉花中;(3)授粉後的母本棉花所結的種子便是轉基因棉花種子，實現了棉花的基因轉化。此方法無需組織培養步驟，直接在活體棉花上便實現基因轉化，實用、易操作、不依賴組織培養、穩定性好。 ^[2]