嗜冷酶

從1887年Forster發現0℃下生長的微生物以來，嗜冷菌的概念有十幾種，其中較為公認的是根據生長温度的不同將嗜冷菌分為專性嗜冷菌和兼性嗜冷菌的概念。專性嗜冷菌是指生長温度不超過20℃的一類微生物， 它們的最適生長温度不超過15℃， 在0℃及以下可以生長繁殖；而兼性嗜冷菌最高生長温度可以超過20℃，在0-5℃的環境中可以生長。嗜冷菌中產生的很多酶在低温下才顯示高效的催化效率， 而在高温下很快失活，這類酶稱為嗜冷酶。

Ohgiya等人將嗜冷酶分為3類：第一類酶和同類嗜温酶有相似活性但是熱穩定性差於嗜温酶；第二類在低温下活性強但是熱穩定性更差；第三類是低温下活性強且熱穩定性也較強，但大多數嗜冷酶屬於第一、二類，第三類極少，投入應用的嗜冷酶主要屬於第二類。隨着研究的逐漸加深及應用範圍的逐步擴大，嗜冷酶越來越多地被用於工業生產中。

嗜冷酶分子結構一般具有如下一些特徵:1、與蛋白構象穩定性有關的分子內靜電弱相互作用減小；2、蛋白核心區域疏水作用下降；3、溶劑相互作用及表面親水性升高；4、具有獨特性質的環狀結構的插入/刪除、與二級結構有關的環狀結構或轉角中脯氨酸的減少；5、蛋白功能域附近甘氨酸的堆積；6、精氨酸含量減少；7、靠近活性位點關鍵區域氨基酸的取代；8、離子束縛作用( ion binding) 減弱；9、蛋白質摺疊。

物質的結構決定其功能與性質,嗜冷酶的耐冷性肯定與結構的變化有內在的聯繫。

嗜冷酶大部分具有以下酶學特徵：1、在低温下具有較高的催化效率。這是嗜冷酶的基本特徵。與同類中温酶相比，嗜冷酶在低温下的酶活性要高出數倍甚至十幾倍，如在4℃時嗜冷酶比中温酶的轉換數(kcat) 高33倍。但是，嗜冷酶對低温的適應還不徹底，這表現在嗜冷酶雖然在低温下具有較高的酶活性，但仍然低於同類中温酶在37℃下的酶活性；2、具有較低的最適催化温度。由於嗜冷酶對熱敏感，其最適催化温度一般都比同類中温酶和高温酶明顯低；3、具有較高的熱敏感性。嗜冷酶只能在相對低的温度下保持高催化效率，温度稍高即很快失活，表現出很高的熱敏感性，如海產弧菌細胞中的蘋果酸脱氫酶於30℃處理10min 酶活力完全喪失。丙酮酸脱羧酶在35℃處理30min, 酶活力損失90%。嗜冷酶的熱變性温度均比同類中温酶低15～20℃。

嗜冷酶的特殊性質使其在工業生產應用中具有一些優勢: 低温下催化反應可防止污染( 同源的嗜温酶不活潑)；經過温和的熱處理即可使嗜冷酶的活力喪失, 而低温或適温處理不會影響產品的品質等。

1993 年, Rentier小組對幾種嗜冷性蛋白酶、脂酶和半乳糖苷酶進行了研究, 發現它們含有幾個嗜温酶所沒有的“額外”氨基酸殘基。Feller等人建立的計算機模型也表明,嗜冷蛋白酶含有大量帶負電荷的氨基酸殘基,特別是天冬氨酸殘基；分子表面的四個極性環狀結構呈伸展狀態；分子內缺少離子間作用與疏水作用。這些結構特徵使酶分子呈鬆散狀態, 具有較大的可變性, 從而導致酶的穩定性降低。Gerday對幾種嗜冷酶的研究表明,這些酶與嗜温酶相比, 鹽橋更少, 疏水基團更少,芳香烴-芳香烴反應更少,這些都增加了酶的柔性。脯氨酸和精氨酸殘基也較少。脯氨酸的結構熵比其它氨基酸小, 更易摺疊, 需更高的能量才能解開, 可提高酶的熱穩定性。高催化效力與更鬆散而更具柔性的蛋白質結構形成相關聯,這種蛋白質結構容許利用更少的能量投入就產生具有催化效能的構象變化,這樣,嗜冷酶代謝反應所需的活化自由能與嗜温酶相比具有更低的值。對酶晶體進行化學交聯可使嗜冷酶更穩定。主要是因為酶晶體的晶格裏,酶蛋白的穩定性接近理論的極限值,蛋白質與蛋白質間由親水作用和靜電張力捆結在一起, 使蛋白質對熱和其它變性因素的抗性明顯增加,蛋白質的伸展、凝集和裂解作用減少, 而且活性比遊離酶高。由於蛋白質動力學研究嗜冷酶適冷機制的常用途徑是取代突變，即在酶蛋白的某個位點改變氨基酸種類來改變蛋白質的高級結構, 再篩選出熱穩定性增加或下降的突變株。由此可以看出,酶的穩定性、活性及柔性之間有一定關係。

到目前為止,還沒有在嗜冷酶中發現一種或幾種與耐冷性有關的模式結構,這説明不同的酶以多種不同的結構上的變化、同一種酶以多種變化的總和來維持低温條件下的高催化活性。這些變化包括：酶分子具有更大的柔韌性和較小的功能域：減少了亞基表面之間的相互作用並增加了暴露於溶劑中疏水殘基的數量：酶的活性中心更容易接近底物, 且酶與底物的親合力更大(較低的Km值)等。這些結構特點是嗜冷酶耐受低温的主要機制。

2.1 對食品加工的益處

嗜冷酶在較低温度下具有比嗜温酶更強的活性,利用這一特點,眾多必須在低温條件下進行的催化反應可以更高效的進行，並避免了一些高温下不必要的化學反應的發生，如在食品工業中保持食品風味要求生產温度不能過高。同時, 較低的催化温度為工業生產應用節約了大量能源。嗜冷酶的應用不但利用其高特異活性,節省酶量,而且也因為它們易失活, 從而使酶作用終止。這樣對食物的口感和質量有很好的保持作用, 而不必擔心酶持續作用改變食物的結構。在食品加工過程中, 較低的温度可減少其它中温菌的污染, 縮短加工時間, 避免加熱系統的熱能消耗。冷活性澱粉酶和蛋白酶還可在低温條件下加速原料的粉碎過程。在以上方面來説, 嗜冷酶是嗜温酶的良好替代物。

嗜冷酶在食品工業方面的應用潛力是巨大的，冷活性的蛋白酶、脂酶、果膠酶、纖維素酶等已被用於食品加工過程中，其中脂酶和蛋白酶具有相當大的應用潛力,脂酶可應用於許多方面, 如作為食品的風味改變酶、去污添劑添加物或立體特異性催化劑等；蛋白酶也可被大量應用於食品工業(啤酒的處理, 麪包店中的應用, 發酵食品的生產, 奶酪生產中的加速成熟作用等)。

α-澱粉酶是第一個被成功結晶的嗜冷酶，其最適催化温度比中温α-澱粉酶低30℃,在4℃和25℃下, 其催化效率kcat/Km 分別為嗜温酶的6.6、3.7倍。

在乳品工業中所常用的嗜冷酶有脂酶、凝乳酶、過氧化氫酶，脂酶用於乳製品的增香；在乳酪製造業中, 使用嗜冷的凝乳酶,可防止剩餘的蛋白質水解。在牛奶冷藏的過程中, 需要加入過氧化氫進行殺菌, 而過剩的過氧化氫可以用耐冷的過氧化氫酶來分解。脂酶還可用於乳製品和黃油的增香、生產類可可脂、提高魚油中n-3 系多聚不飽和脂肪酸含量等。乳品行業中, 在低温下使用β-半乳糖苷酶來降低牛奶中造成三分之二世界人口嚴重誘導乳糖不耐症的乳糖含量，同時能縮短水解時間, 還可減少細菌污染的風險。採用嗜冷性微生物蛋白酶在固定化反應器中製作的豆奶凝乳中只產生輕微的凝塊。

在肉類加工工業中, 蛋白酶有助於使肉變嫩, 理想的肉類柔嫩酶可在低温條件下作用於結締組織膠原和彈性硬蛋白, 並可在50 ℃左右失活, 在肉類pH值(pH 4-5)狀態下也具有良好的活性。木瓜蛋白酶已經被用於這一方面, 但到目前為止,還沒有微生物來源的蛋白酶被利用, 這主要是由於作用於結締組織的酶活性太低。

在糕點烘烤的過程中, 嗜冷性澱粉酶、蛋白酶和木糖酶能減少生麪糰發酵時間, 提高生麪糰和麪包心的質量及香味和濕度的保留水平。使用嗜冷酶的優勢不僅體現在其高度專一活性方面, 而且也體現在其易失活方面。這阻止了酶的繼續反應, 從而避免了麪包瓤結構的改變, 因而不至於使麪包變得太軟或太粘。

果汁行業中, 使用果膠酶有助於在果汁提取過程中降低飲料黏度, 使得產品更加清澄，其他一些嗜冷酶也是嗜温酶的良好替代品, 可應用於葡萄酒、啤酒、白酒等釀造、動物飼養等行業。

在水產行業，Biotec的酶列表中包括蝦減性磷酸酯酶、鱈尿嘧啶DNA糖基化酶(DNA glycosylase，一個重組蛋白)、來自北極扇貝的溶解酵素、鱈胃蛋白酶(作用於蛋白質水解、魚子醬的生產及除魚鱗)和一種能有效去魷魚皮的酶。

低温細菌、酵母真菌及微藻中都積聚有大量富含不飽和脂肪酸的脂質, 其具有降血脂、降糖和防癌等生理功效。嗜冷酶在其他方面的應用研究也在逐步進展中,如膳食不飽和脂肪酸、作為防凍保護劑的抗凍蛋白、食品發酵中的低温酵母等。

2.2 對食品的危害

嗜冷酶對食品產生的危害主要在乳製品方面。

嗜冷菌可以產生脂肪酶、蛋白酶，這些熱穩定性胞外降解性酶類在巴氏消毒過程中基本不受影響，這類脂肪酶和蛋白酶甚至經過UHT處理後仍能保持部分活性，導致脂肪酶分解原料奶中的脂肪球，產生遊離的短鏈脂肪酸而使原料奶酸度升高導致腐敗，又由於遊離脂肪酸增加，將導致乳產品風味變差，如乳酪味、腐爛味、不潔味或酵母味等。蛋白酶可分解原料奶中的蛋白，導致如產品發苦，在水解過程中釋放的氨基酸會使褐變反應加劇，分解酪蛋白，引起蛋白膠凝化。

UHT滅菌奶的凝結和苦味均與嗜冷菌產生的蛋白分解酶有關。苦味的產生主要是由蛋白酶水解蛋白質形成一定分子量範圍內的肽造成的。此外，脂肪酶分解脂肪形成低分子醛、酮類物質時也有苦味。蛋白質和脂肪水解程度不同，也會使產品產生異味和變粘稠。因此在UHT奶貯存過程中，蛋白酶與脂肪酶對產品的品質影響比較顯著。這些由嗜冷菌產生的脂肪酶、蛋白酶不僅還會導致牛奶的物理品質和感官品質下降、貨架期縮短，還會造成片式熱交換器的淤塞，使清洗困難。

有一些學者認為，在UHT乳貯存期間發生的老化膠凝現象是由乳中殘留的蛋白酶活性造成的，其中起主要作用的酶是天然乳蛋白酶（纖維蛋白酶）和微生物蛋白酶。這些高耐熱性酶，在UHT 乳貯存中繼續發揮水解作用，從而使蛋白質水解。微生物蛋白酶主要水解κ-CN，生成副-κ- CN，從而使κ- CN 失去對蛋白質的穩定作用，使蛋白質聚集，最終由於蛋白質自身的重力作用沉於底部，隨着時間的延長逐漸析出乳清，產生凝膠。另外，UHT 乳貯存期間，蛋白酶水解乳中蛋白，釋放出一些產生苦味的氨基酸和短肽，會對乳的風味造成不良影響。有研究表明，當牛乳中熱穩定性蛋白質量濃度達到1 ng/mL 時，就足以縮短UHT奶的貨架期 ^[2]  。

有關嗜冷酶的研究日益增多，相信隨着研究的持續深入以及生物工程技術的充分利用，嗜冷酶在獲取途徑、活性改造、應用範圍方面都會取得突破性進展，嗜冷酶工業應用前景將會更廣闊。