半乳糖苷酶

α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，α-gal，EC 3.2.1.22）是催化α-半乳糖苷鍵水解的一種外切糖苷酶，因能分解蜜二糖，又稱蜜二糖酶，它能催化α-半乳糖苷鍵的水解。這一特點使得它可用於改善和消除飼料及豆制食品中的抗營養成分。此外，它在醫學領域中能實現B→O血型轉變、製備通用型血，以及在法布里病的酶替代治療中也發揮了重要作用。α-半乳糖苷酶還可作用於含α-半乳糖苷鍵的複合多糖、糖蛋白和鞘糖。某些α-半乳糖苷酶在底物濃度高度富集的情況下還具有轉半乳糖基作用，利用這一特點可用於低聚糖的合成及製備環糊精衍生物。開發嗜中性或具pH 穩定性的α-半乳糖苷酶，尋找高產酶量的微生物或植物，成為近幾年的研究熱點。許多耐熱α-半乳糖苷酶也因其特殊性逐漸引起了科學家們的廣泛興趣，期望利用其熱穩定性在工業方面發揮更大的利用價值，以及在科技工藝和醫藥領域顯示出更廣闊的應用前景 ^[1]  。

α-半乳糖苷酶廣泛存在於植物、微生物及動物中，屬於糖苷水解酶第26和37家族。其中，第26家族的α-半乳糖苷酶只來源於真核生物，而第37家族的α-半乳糖苷酶則主要來源於原核生物。根據酶活和最適pH，α-半乳糖苷酶有酸性和鹼性之分。對於植物來源的α-半乳糖苷酶的研究比較多，在植物種子、果實、葉子和塊莖中都發現了該酶，且來源於種子和葉子的多是酸性α-半乳糖苷酶，屬於糖苷水解酶第27家族。鹼性α-半乳糖苷酶多具有合成酶作用，且屬於糖苷水解酶第36家族。植物中研究的α-半乳糖苷酶有咖啡豆、無花果、豆芽、椰子、芋頭塊莖、黃瓜、葡萄、水稻、木瓜等；種子中有大豆、斑豆、蕃茄等；細菌中有鏈黴菌、脆弱芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、發酵乳桿菌、嗜熱絲袍菌、雙歧桿菌等；真菌中有葡酒色被孢黴、根黴、產紫青黴、里氏木黴、煙麴黴、草酸青黴、寄生麴黴、黑麴黴、臭麴黴、分枝犁頭黴、米麴黴等。在各種哺乳動物組織的勻漿中也存在α－半乳糖苷酶，人和鼠的甲狀腺、腎臟和脾臟酶的活性最高。隨着分離純化技術的發展，得到了越來越多的純化酶，分子生物學的迅速發展也為α-半乳糖苷酶的研究開創了新的領域。通過基因工程技術，人們已經從動物器官、植物、細菌和真菌等生物體中克隆出許多α-半乳糖苷酶基因，許多α-半乳糖苷酶也因其耐熱性而受到越來越多的關注。來源於布氏棲熱菌的α-半乳糖苷酶能耐受的最高温度達93 ℃；從嗜熱脂肪芽孢桿菌分離純化α-半乳糖苷酶的最適温度為65℃。已研究較多的是具有熱穩定性的α-乳糖苷酶菌株和嗜熱菌、耐熱梭狀芽孢桿菌等。這些從嗜熱或耐熱微生物中獲得的熱穩定α－半乳糖苷酶可解決其應用過程中存在的熱不穩定性問題，對該酶的推廣和使用具有重要意義 ^[1]  。

α-半乳糖苷酶的催化作用是移除底物末端α-連接的非還原性D-半乳糖，或通過轉糖基作用將半乳糖基團以α-1,6糖苷鍵轉移到受體C6位的羥基上。含有這一類糖苷鍵的底物和受體在自然界中分佈廣泛，因此，α-半乳糖苷酶在工業、食品、醫療和科學研究中有着廣泛的應用，被認為是最有應用潛力的酶製劑之一。

玉米—豆粕型飼料因具有粗蛋白質含量高、氨基酸含量平衡且富含賴氨酸等營養特點，是很好的蛋白質飼料來源。但豆粕及雜粕類飼料中α-半乳糖苷糖類含量相對較高，在飼料中是一種抗營養因子，簡單的加工方法難以將其分解，且單胃動物不能分泌消化該類物質的酶，只有通過微生物發酵後才能利用寡聚糖，而產生的揮發性脂肪酸和各種氣體均能使動物腸胃脹氣、腹痛、腹瀉、噁心和厭食等。另外，這些低聚糖還能刺激腸道蠕動、提高飼料通過消化道的速度、減少食糜在消化道停留的時間，從而影響營養物質的消化和吸收用棉籽糖類餵養老鼠，結果發現多數老鼠發生腹瀉，同時還在排泄物中發現了棉籽糖的殘留物，於是首次提出了α-半乳糖苷的抗營養作用，之後進一步的研究相繼證實這一結果。α-半乳糖苷被認為是動物攝入飼料之後引起腸道腹脹的主要因素；試驗結果表明，豆科植物中α-半乳糖苷的量與腸道產氫量呈正相關，因此，分解去除飼料中的抗營養因子α－半乳糖苷顯得尤為重要。在飼料中添加外源α-半乳糖苷酶製劑，可專一性的催化水解α-1，6糖苷鍵，使α-半乳糖苷分解得到低聚寡糖和單糖。研究結果表明，與未經處理的豆粕相比，用α-半乳糖苷酶處理後的豆粕飼餵雞可使糞便中棉籽糖和水蘇糖分別減少69%和54%，淨代謝能和生長性能都有明顯增加（P<0.05）；以α-半乳糖苷酶為主的複合酶添加於肉雞玉米—豆粕型日糧中，結果發現飼料的效率提高了1%～10%，胴體產量提高了10%～20%，腹脂率降低了10%～20%，這表明α-半乳糖苷酶將抗營養因子消除之後，提高了營養物質分配效率；類胰島素生長因子（IGF-I）分泌不受抑制，可節省蛋白質合成氨基酸，從而提高瘦肉率，降低飼料成本；在基礎日糧中添加α-半乳糖苷酶，結果發現肉仔雞的生長性能、能量和養分表觀代謝率及消化酶的活性均有顯著提高。

總之，α-半乳糖苷酶可有效降解飼料中存在的α-半乳糖苷等抗營養因子，降低食糜黏度，減少幼齡動物腹瀉發病率；可摧毀植物細胞壁結構，促進細胞內營養物質釋放，提高利用效率；節省蛋白質和合成氨基酸，提高瘦肉率；增強動物的免疫功能和抗病能力，減少飼料中抗生素的用量；減輕或避免消化器官代償性增生和肥大，降低動物維持需要量，提高飼料能量效價；擴大飼料配方中原料使用種類，充分利用副產品等非常規飼料資源，降低配方成本等。

α-半乳糖苷酶還可用於糖類的合成。糖苷鍵的合成可以使用標準的化學合成方法，但通常需要一些繁瑣複雜的保護與去保護步驟。由於酶的穩定性和低成本，通過酶法來合成顯示出很好的前景，但其主要缺點是可選擇性和產量都不高。α-半乳糖苷酶在造紙工業上也有一定應用。阿拉伯木聚糖和半乳葡聚甘露聚糖是軟木中主要的半纖維素組分。α-半乳糖苷酶可以水解半纖維素類的半乳葡聚甘露聚糖，使α-半乳糖從其碳鏈骨架上分離下來。儘管單獨使用α-半乳糖苷酶處理造紙加工過程中的軟木紙漿對紙張的漂白無影響，但用木聚糖酶、甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶共同處理，則可以提高紙張的漂白效果。

β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）屬於糖苷水解酶，存在多種微生物來源，除了水解活性，某些來源的 β-半乳糖苷酶也具有轉糖基活性。來源不同的酶具有不同的特性，例如酶的最適 pH，最適温度，動力學常數Km會有所區別。此外，酶的來源不同，如克魯維酵母、麴黴、芽孢桿菌、鏈球菌和隱球菌屬和不同的反應條件，如温度和 pH，酶反應合成低聚半乳糖的聚合度、產率及形成糖苷鍵的類型也不同 ^[2]  。

β-半乳糖苷酶由β-半乳糖苷酶基因（LacZ 基因） 編碼，是由4 個亞基組成的四聚體，一般可催化乳糖分解為一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖。從不同物種提取的β-半乳糖苷酶的蛋白質序列有着較高的同源性和相似性。β-半乳糖苷酶的分子質量在100~850 ku 之間，其中大腸桿菌的β-半乳糖苷酶分子質量最大，為520~850 ku。已有多種來源的β-半乳糖苷酶基因被克隆。

β-半乳糖苷酶的主要來源有：① 細菌、黴菌、酵母等微生物，其中細菌中的乳酸菌、大腸桿菌等，黴菌中的米麴黴、黑麴黴等，酵母中的脆壁克魯維酵母、乳酸克魯維酵母等，放線菌中的天藍色鏈黴菌等；② 植物，尤其是杏、扁桃和蘋果等；③ 哺乳動物，特別是幼小哺乳動物的小腸中。僅來源於微生物的β-半乳糖苷酶有工業應用價值，商業用酶源一般認為酵母（如乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母） 最為安全，其次為黑麴黴。

不同來源的β-半乳糖苷酶最適pH 在4.0~7.5之間不等。最適pH 不同決定了來源不同的β-半乳糖苷酶各自的用途不同，如黴菌所產生的β-半乳糖苷酶的最適pH 偏酸性（pH 2.5~5.0），適用於酸性乳清和乾酪的水解（含大量乳糖）；而酵母和細菌所產生的β-半乳糖苷酶的最適pH 近中性（分別為pH 6~7 和pH 6.5~7.5），適於牛乳（pH 6.6）和鮮乳清（pH 6.1）的水解。β-半乳糖苷酶的最適作用温度範圍較寬，在37~50 ℃之間。酵母β-半乳糖苷酶的最適作用温度在35 ℃左右；而黴菌的最適作用温度一般在50 ℃以上，最高可達60 ℃；環狀芽抱桿菌可達65 ℃；嗜熱水生菌則為80 ℃。耐高温微生物菌株使用時可避免雜菌污染，所以細菌尤其是嗜熱細菌所產生的β-半乳糖苷酶正得到廣泛的研究。迄今，大腸桿菌產生的β-半乳糖苷酶研究得最徹底，並已大量應用於生化分析 ^[3]  。

β-半乳糖苷酶除了能夠催化β-半乳糖苷化合物中的β-半乳糖苷鍵發生水解，還具有轉半乳糖基的作用。早期的研究表明，β-半乳糖苷酶上的活性位點有兩個功能團：Cys 的巰基和His 的咪唑基，它們對β-半乳糖苷酶水解乳糖起重要作用。據推測，硫基可作為廣義酸使半乳糖苷的氧原子質子化，而咪唑基可作為親核試劑進攻半乳糖分子第1個碳原子上的親核中心，形成1 個含碳氫鍵的共價中間物。在被切割下咪唑基之後，巰基陰離子從水分子中抽取1個質子，從而形成-OH 進攻C。有研究認為乳糖酶的催化機制與溶菌酶類似。當半乳糖苷的受體是水時，發生的是水解；當受體是另外的糖或醇時，則發生轉半乳糖苷作用；如受體是乳糖，則可以生成三糖的低聚半乳糖 ^[3]  。

β-半乳糖苷酶應用的研究熱點主要集中在固定化、生產低聚糖和使用基因工程技術生產乳糖酶等方面 ^[3]  。

β-半乳糖苷酶在食品加工方面的應用主要包括以下幾個方面：

1 解決乳糖不耐受患者的乳品消費問題

世界上平均約70%~90%的成年人（尤其是亞洲和非洲人）喝牛奶後會因缺乏β-半乳糖苷酶不能降解牛奶中大量的乳糖而產生乳糖不耐受，我國乳糖不耐受症的發生率為90%左右。用β-半乳糖苷酶水解牛乳中的乳糖，可將乳糖含量降低70%~80%，解決乳糖不耐受患者的乳品消費問題。

2 用於提高乳製品的甜度

乳糖的甜度較低，只有蔗糖的20%，水解後1分子乳糖生成1 分子葡萄糖和1 分子半乳糖，可以明顯提高乳製品的甜度，減少甜味劑的用量。

3 防止乳製品冷凍時出現結晶

乳糖的溶解度較低，在製作冷凍乳製品時容易結晶析出，影響產品質量。在加工中添加25%~30%的乳糖水解乳，可防止這類問題的出現。

4 生產低聚半乳糖

低聚半乳糖是以牛乳或乳清中的乳糖為底物，經β-半乳糖苷酶催化生成的。低聚半乳糖的甜度為蔗糖的20%~40%，熱穩定性較好，在酸性條件下也是如此，可作為雙歧桿菌增殖因子，促進鈣質吸收和有機酸生成、降低腸道pH、抑制外源菌生長和改善脂質代謝。

5 應用於發酵乳製品

用β-半乳糖酶水解乳製作酸乳比使用普通脱脂乳製備酸乳可以縮短乳凝固時間約15%~20%，且節省蔗糖用量，能改善酸乳的風味和口感。另外，由於乳酸菌生長快，菌數多，還能延長酸乳的貨價期。

6 應用於乳清加工

乳清中含有乳清蛋白、乳糖、礦物質和維生素等營養成分，其中乳清蛋白是完全蛋白質。世界年產乳清約為9×107 t，其中50%當廢水排放，不僅造成浪費，而且污染環境。用β-半乳糖苷酶將乳清中的乳糖水解，可去除乳清濃縮時乳糖結晶析出給加工帶來的不便。另外，用此水解物還可生產乳清飲料、糖漿和食品添加劑等。

7 分析乳製品中的乳糖含量

將精製的β-半乳糖苷酶和其它酶（如過氧化物酶、葡萄糖氧化酶）聯合使用，可以分析冰淇淋、乾酪等乳製品中的乳糖含量。該法簡便快捷，費用低廉，可以在樣品不除去蛋白的情況下使用，適合在食品工業上應用。

8 促進果蔬軟化和成熟

β-半乳糖苷酶普遍存在於各種植物中，一般在植物成熟期β-半乳糖苷酶的含量增加，它能降解含半乳糖苷的胞壁多糖，釋放遊離的半乳糖。可溶性半乳糖能促進胡椒成熟，促發番茄乙烯生成加快成熟。β-半乳糖苷酶已應用於梨、蘋果、土豆、中國水粟等的軟化和番茄、胡椒、甜瓜、櫻桃、核果、牛油果等的促成熟。

β-半乳糖苷酶在免疫和檢測方面的應用：

在免疫方面，Romanos 等將β-半乳糖苷酶與人體胞外澱粉狀蛋白前體融合形成融合蛋白，作為Alzheimer 病的免疫源，並進一步製備了其單克隆抗體。在免疫檢測方面，β-半乳糖苷酶經戊二醛一步標記抗人IgG，建立了ELISA 測定程序，已用於人IgG、人羣破傷風抗體和單克隆抗體檢測，並已獲得了滿意的結果。同時還用於孕酮、皮質醇半抗原標記，初步建立了該酶的液相競爭測定程序。近年來，又有報道合成了該酶的大分子底物，因此β-半乳糖苷酶不僅可用作超微量熒光酶聯分析，而且還可以在酶放大免疫測定（EMIT）和底物標記熒光分析（SLFI-A）中進行應用。在環境檢測方面，大腸桿菌β-半乳糖苷酶活性檢測可快速分析浴場和漁場地區海水水體受排泄物污染程度。

β-半乳糖苷酶基因在基因工程中的應用：

β-半乳糖苷酶基因被廣泛地應用於包括作為報告基因、構建載體、轉基因研究和基因治療等多個分子生物學研究領域。具體介紹如下：

1在載體構建中的應用

β-半乳糖苷酶可催化X-ga1（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷） 水解，產物呈藍色，易於檢測和觀察，基於這一特點，β-半乳糖苷酶基因常作為載體組分，廣泛地應用於各類研究中。分子生物學研究使用的許多克隆載體一般都具有一段大腸桿菌β-半乳糖苷酶的啓動子及其α 肽鏈的DNA序列，可通過藍白選擇方便地篩選出陽性重組載體。

2 作為報告基因的應用

β-半乳糖苷酶基因是動物和微生物基因工程中最常用、最成熟的一種報告基因。報告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，其表型應易於檢測且易於與內源性背景蛋白相區別，利用其表達產物來標定目的基因的表達調控。β-半乳糖苷酶基因作為報告基因的應用主要有以下幾個方面：① 用於研究啓動子的效能和啓動子不同位點突變對錶達效能的影響；② 用於研究表達系統中增強序列等調控序列的功能；③ 用來衡量載體的表達特性和外源物質對錶達調控的影響；④ 以融合基因的形式用於研究外源基因的表達及其規律。