傳代培養

1．懸浮生長細胞傳代

多采用離心法傳代。1000轉/分,20-30秒後去上清。沉澱細胞加新培養液後再混勻傳代。亦有直接傳代法，即懸浮細胞沉澱在瓶壁時，將上清培養液去除1/2-1/3，然後用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代.

2．半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）

此類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脱落下來，進行傳代。

3．貼壁生長細胞傳代

採用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。

1、無菌磷酸生理緩衝液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS, GibcoBRL21600-010)

2、trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：以10ml分裝於15ml無菌離心管中，保存於–20℃，使用前放在37℃水槽回温。

3、新鮮培養基

4、無菌吸管/離心管/培養瓶

1、附着型胞(adherentcell)

（1）吸掉舊培養液。（2）用D-PBS洗滌細胞一至二次。

（3）加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用數分鐘，於倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA溶液。（若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作用後，加入適量含血清之新鮮培養基終止trypsin作用，離心後再吸掉上清液。）

（4）輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脱落，加入適量之新鮮培養基，以吸管上下吸放數次以打散細胞團塊，混和均勻後，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。

2、懸浮型細胞(suspensioncell)

（1）吸出細胞培養液，放入離心管中，離心1000rpm5分鐘。

（2）吸掉上清液，加入適量之新鮮培養基，混和均勻後，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。

3、融合瘤(hybridoma)

（1）有些hybridomacell需培養三天以上才會產生抗體，若是更換培養基，則可能會失去抗體。因此繼代培養不需離心後更換培養基，直接添加新鮮培養基稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養瓶中。

原代培養：即第一次培養，是指將培養物放置在體外生長環境中持續培養，中途不分割培養物的培養過程。有幾方面含義：

1、培養物一經接種到培養器皿（瓶）中就不再分割，任其生長繁殖；

2、原代培養中的“代”並非細胞的“代”數，因為培養過程中細胞經多次分裂已經產生多代子細胞；

3、原代培養過程中不分割培養物不等於不更換培養液，也不等於不更換培養器皿。

正常細胞培養的世代數有限，只有癌細胞和發生轉化的細胞才能無限生長下去。所謂轉化即是指正常細胞在某種因子的作用下發生突變而具有癌性的細胞。世界上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細胞系就是1951年從一位名叫Henrietta Lacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培養而成。此細胞系一直延用。 原代培養是建立各種細胞系（株）必經的階段，其是否成功與組織污染與否、供體年齡、培養技術和方法、適宜培養基的選擇等多種因素有關。由於原代培養的細胞轉化性極小，對病毒敏感性好，因此適應製備疫苗等生物製品；但也存在有潛在外源因子、不能事先檢查標本、且受供體年齡健康狀況的影響而導致批間差異大等缺陷。常用的原代細胞培養有雞胚成纖維細胞及豬腎、猴腎、地鼠腎等原代細胞。

原代培養的基本過程包括取材、培養材料的製備、接種、加培養液、置培養條件下培養等步驟，在所有的操作過程中，都必須保持培養物及生長環境的無菌。

多數情況下，分散的細胞若屬於貼壁依賴型細胞，就能黏附、鋪展於培養器皿和載體表面生長而形成細胞單層，這種培養方式稱為單層細胞培養（monolayerculture），又叫貼壁培養（adherentculture）。少數情況下，培養的細胞沒有貼壁依賴性，可通過專門設備使細胞始終處於懸狀態而在體外生長，這種形式稱為懸浮培養（suspensionculture）。如何讓接種的細胞儘快貼壁，是決定培養成功的關鍵步驟：

1、取決於適當的生長基質表面；

2、可降低接種後培養液對細胞的浮力，如先少補加少量培養液，待細胞貼壁後再補足營養液繼續培養；

3、注意適當的細胞接種密度，一般105個/ml左右。

體外培養技術中所謂的傳“代”概念並不等於細胞生物學中“親代細胞”與“子代細胞”中“代”的概念。傳代培養的實質就是分割後再一次培養，可以相對地衡量培養物的培養年齡。

傳代培養是組織培養常規保種方法之一。也是幾乎所有細胞生物學實驗的基礎。當細胞在培養瓶中長滿後就需要將其稀釋分種成多瓶，細胞才能繼續生長。這一過程就叫傳代。傳代培養可獲得大量細胞供實驗所需。傳代要在嚴格的無菌條件下進行，每一步都需要認真仔細的無菌操作。

材料：培養瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75%酒精棉球，酒精燈，培養細胞。

藥品：培養基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，Hank's液。

儀器：CO₂培養箱，倒置顯微鏡，超淨台。

1．入無菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒雙手。

2．倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數。將培養用液置37℃下預熱。

3．超淨台台面應整潔，用0.1%新潔爾滅溶液擦淨。

4．打開超淨台的紫外燈照射枱面20min左右，關閉超淨台的紫外燈，打開抽風機清潔空氣，除去臭氧。

5．點燃酒精燈；取出無菌試管，巴斯德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒後插在無菌試管內。

6．將培養用液瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰後斜置於酒精燈旁的架子上。

7．倒掉培養細胞的舊培養基。酌情可用2—3mLHanks液洗去殘留的舊培養基，或用少量胰酶涮洗一下。

8．每個大培養瓶加入1mL胰酶，小瓶用量酌減，蓋好瓶蓋後在倒置顯微鏡下觀察，當細胞收回突起變圓時立即翻轉培養瓶，使細胞脱離胰酶，然後將胰酶倒掉。注意勿使細胞提早脱落入消化液中。

9．加入少量的含血清的新鮮培養基，反覆吹打消化好的細胞使其脱壁並分散，再根據分傳瓶數補加一定量的含血清的新鮮培養基(7～10mL/大瓶，3～5mL/小瓶)製成細胞懸液，然後分裝到新培養瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊後再稍迴轉，以利於CO₂氣體的進入，將培養瓶放回CO₂培養箱。

10．對懸浮培養細胞，步驟7-9不做。可將細胞懸液進行離心去除舊培養基上清，加入新鮮培養基，然後分裝到各瓶中。

【注意事項】

1．傳代培養時要注意無菌操作並防止細胞之間的交叉污染。所有操作要儘量靠近酒精燈火焰。每次最好只進行一種細胞的操作。每一種細胞使用一套器材。培養用液應嚴格分開。

2．每天觀察細胞形態，掌握好細胞是否健康的標準：健康細胞的形態飽滿，折光性好，生長緻密時即可傳代。

3．如發現細胞有污染跡象，應立即採取措施，一般應棄置污染的細胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BSS或培養基反覆清洗，隨後培養基中加入較大量的抗菌素，並經常更換培養基等。

一、原理

細胞在培養瓶長成緻密單層後，已基本上飽和，為使細胞能繼續生長，同時也將細胞數量擴大，就必須進行傳代（再培養）。

傳代培養也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經消化後才能分瓶。為了保持細胞正常的二倍體核型，傳代培養一般只培養到10代。

二、材料和試劑

1、細胞：貼壁細胞株。

2、試劑：0.25%胰酶、1640培養基（含10%小牛血清）。

3、儀器和器材：倒置顯微鏡，培養箱、培養瓶、吸管、廢液缸等。

三、操作步驟

1、將長滿細胞的培養瓶中原來的培養液棄去。

2、加入0.5—1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底細胞都浸入溶液中。

3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細胞。隨着時間的推移，原貼壁的細胞逐漸趨於圓形，在還未漂起時將胰酶棄去，加入10ml培養液終止消化。

觀察消化也可以用肉眼，當見到瓶底發白並出現細針孔空隙時終止消化。一般室温消化時間約為1—3分鐘。

4、用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，實踐培養液塞好橡皮塞，置37℃下繼續培養。第二天觀察貼壁生長情況。

附：消化液配製方法：

稱取0.25克胰酶蛋白酶（活力為1：250），加入100ml無Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，濾器過濾除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。

胰酶溶液中也可加入EDTA，使最終濃度達0.02%。

在口腔醫學領域，儘管人們已經能夠重新構建牙冠結構，然而重新構建結構複雜的牙根始終是不少科研人員的終極夢想。第四軍醫大學口腔醫院文玲英教授等在一項國家自然科學基金資助課題中，培養出了純化的牙囊細胞，儘管這離重新構建牙根還有很長的距離，但畢竟又向前邁了一步。 牙囊是牙胚的重要組成部分，隨着牙齒的發育，由它分化的細胞形成牙骨質、牙周膜和部分牙槽骨，換句話説，由牙囊發育的組織結構主要負責將牙齒固定在牙槽骨上。另外在牙齒萌出的過程中，牙囊細胞還可能通過對一些細胞和因子進行調控，促進牙齒的順利萌出。

牙囊細胞的重要功能吸引了研究者的目光，但要進行深入的研究就需要首先分離出純化的牙囊細胞。早在上世紀90年代，國外就已經開展了分離牙囊的研究，但由於牙囊與成釉器（上皮來源）“關係密切”，始終難以簡便地獲得純化的牙囊細胞。

據研究人員劉曉輝介紹，牙囊細胞和成釉器分別來源於外胚間充質和口腔上皮，這兩類細胞在培養時對培養皿具有不同的黏附能力，當使用胰酶消化時，黏附能力較差的牙囊細胞會首先掉下來，成釉器上皮細胞則要慢一些，這就是差速消化的概念。利用差速消化法，收集牙囊細胞並進行傳代培養，就稱為差速傳代技術。經3～4次差速傳代，最終就可以得到純化的牙囊細胞了。

在研究過程中，他們選用大鼠第一和第二磨牙牙胚，剝離出牙囊和成釉器作混合培養，經3次差速傳代後，成功地從第4代牙胚原代細胞中獲得了純化的牙囊細胞。經細胞形態學及免疫化學染色檢測結果顯示純化率達100%，細胞生長狀態良好，增殖旺盛。

文教授説，差速傳代培養技術是一種很有效且操作簡單、廉價的研究方法，培養的高純化牙囊細胞為今後牙齒組織工程提供了種子細胞，下一步他們準備將純化牙囊細胞應用於牙根的重新構建研究中。