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鱟試劑
鎖定
鱟試劑是由海洋節肢動物鱟的血液變形細胞溶解物製成的無菌冷凍乾燥品,含有能被微量細菌內毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原,凝固蛋白原,是從棲生于海洋的節肢動物"鱟"的藍色血液中提取變形細胞溶解物,經低温冷凍乾燥而成的生物試劑,能夠準確、快速地定性或定量檢測樣品中是否含有細菌內毒素和(1,3)-β-葡聚糖。
鱟試劑廣泛用於製藥、臨牀以及科研等領域,用於細菌內毒素和真菌葡聚糖檢測。使用的鱟試劑分為美洲鱟試劑和東方鱟鱟試劑兩大類。
鱟試劑鱟試劑簡介
鱟的身上流淌着一種十分珍奇的血液。這種血液是淡藍色的。這種淡藍色的血液中含銅量很高,而且一遇到細菌就會凝固。利用鱟血液的這種特殊反應,對它進行處理,可以製成一種特殊的檢驗試劑——“鱟試劑”。鱟試劑可以準確、快速地檢測人體內部組織是否因細菌感染而致病;在製藥和食品工業中,也可用它對毒素污染進行監測。
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鱟試驗的研究可以追溯到十九世紀八十年代左右,但是在1956年美國的約翰·霍普金斯大學動物學家F.Bang的一篇論文《鱟的一種細菌性疾病》發表後,人們才發現了鱟血液的實際醫用價值。1965年,Dr.Bang與他的合作者製備了沒有血液的鱟血細胞溶解物(LAL),1968年便正式命名為鱟試驗(Limulus Test)。
因此,科學家認為血液呈淡藍色的鱟在醫學研究中有獨特作用。用鱟血製成試劑,再滴入注射液,若試劑立即凝固或變色,就説明注射液內含有使人發熱、休克甚至死亡的細菌內毒素。
鱟試劑試劑分類
鱟試劑按原料來源分
一種是由美洲鱟血液提取的稱美洲鱟試劑(Limulus Amebocyte Lysate),縮寫為LAL,由美國生產;另一種是由東方鱟血液中提取的稱東方鱟鱟試劑(Tachypleus Amebocyte Lysate),縮寫為TAL。TAL與LAL有相同的功效。
鱟試劑按實驗方法分
細菌內毒素檢查法包括兩種方法,即凝膠法和光度測定法,後者又包括濁度法和顯色基質法。則鱟試劑可分為:凝膠法鱟試劑、動態濁度法鱟試劑、終點濁度法鱟試劑、動態顯色法鱟試劑和終點顯色法鱟試劑。凝膠法鱟試劑通過與內毒素產生凝集反應的原理來定性檢測或半定量內毒素的方法。動態濁度法鱟試劑、終點濁度法鱟試劑、動態顯色法鱟試劑和終點顯色法鱟試劑則都是定量檢測內毒素的。
鱟試劑按使用特點分
普通鱟試劑 靈敏度0.5~0.125EU/ml,適用於僅需要檢測內毒素限量的樣品。
高靈敏度鱟試劑 靈敏度0.06~0.015 EU/ml,適用於內毒素限量較低的樣品細菌內毒素檢查。
特異性鱟試劑 靈敏度0.5~0.015EU/ml,適用於成分較為複雜,會對鱟試劑產生干擾的樣品。
鱟試劑實驗方法
凝膠法鱟試劑常見規格為0.1ml/支或0.2ml/支的單個測試或0.5ml/支至5.2ml/瓶的真空封口西林瓶裝的多個測試。使用時一般應加細菌內毒素檢查用水復溶後使用。
動態濁度法鱟試劑、終點濁度法鱟試劑、動態顯色法鱟試劑、終點顯色法鱟試劑,這四種方法都是定量檢測內毒素的。這幾種定量法鱟試劑統稱光度法鱟試劑。
根據檢測原理,終點濁度法和動態濁度法都屬於濁度法。濁度法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。終點濁度法未見商品化產品。動態濁度法(又稱動態比濁法)是檢測反應混合物的濁度上升某一預先設定的吸光度所需要的反應時間,或是檢測濁度增加速度的方法。
動態濁度法的特點為:1. 能準確定量。2.檢測範圍寬,可達4個數量級。3.靈敏度高達0.005EU/ml。4. 操作簡便,系統自動檢測分析,一步即成。5. 經濟實用,試劑樣品需要量少,可降至50μL。6. 和微生物檢測系統Elx808(配套IU)及專用軟件TALgent使用,一次可同時檢測多達96個樣品。
終點顯色法和動態顯色法都是屬於顯色基質法。顯色基質法系利用鱟試劑與內毒素反應過程中產生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團的多少而測定內毒素含量的方法,根據產物顏色判斷內毒素濃度,又稱為比色法。顯色基質法由於不依賴凝固蛋白形成凝膠,抗干擾能力強,特別適用於生物製品(蛋白、疫苗等)和臨牀樣品(黃疸、血液、尿液)的細菌內毒素檢測。
動態顯色法鱟試劑兼有動態濁度法和終點顯色法鱟試劑的優點,抗干擾能力強,使用簡單方便,檢測範圍寬,靈敏度高達0.005EU/ml, 是世界上最好的鱟試劑。但是價格較高。
如果您僅需要檢測樣品的內毒素限量,可以選擇凝膠法鱟試劑,通過確定內毒素限值及最大有效稀釋倍數,做樣品的干擾試驗從而確定使用的鱟試劑的靈敏度。如果您需要定量測定樣品中內毒素含量則應選擇顯色基質鱟試劑盒或動態濁度法鱟試劑。日常檢測量不大時,可以選擇終點顯色法鱟試劑,用普通的分光光度計就可完成實驗。如果您檢測的樣品是生物製品、疫苗、血液製品等最好選用終點顯色法鱟試劑或動態顯色法鱟試劑。如果您日常的檢測量比較大,檢測的樣品對鱟試劑的干擾不大,可選用動態濁度法鱟試劑。動態濁度法鱟試劑特別適用於製藥企業對產品生產過程中的內毒素水平的監控。動態濁度法與動態顯色法需要帶温育系統的動態光度測定儀器及配套軟件。微生物檢測系統El808(配套IU)適用於所有的定量法鱟試驗。
鱟試劑正確使用
保證所使用鱟試劑的質量
鱟試劑的質量主要表現於其靈敏度、自凝時間與成膠狀態三個方面:靈敏度穩定;自凝時間不低於24h;具有一定的緩衝能力與合適的pH;反應後即形成堅實凝膠,將成膠安瓿翻轉180°而不會被破壞。而質量稍差的鱟試劑存放一定時間後(如半年)其靈敏度可能發生變化,而靈敏度的改變會使測定結果所反映的供試品中內毒素的允許限值發生變化。因此,需選擇具有國家頒發的批准文號,質量穩定的鱟試劑。
對鱟試劑靈敏度進行監測性複核
由於不同廠家鱟試劑質量不盡相同,即便是相同廠家不同批號的鱟試劑也有差異,這便導致鱟試劑靈敏度複核值與標示值不盡一致,因此鱟試劑的複核值對檢測結果有顯著影響。每使用新批號鱟試劑時應複核其靈敏度;對留樣鱟試劑自生產之日起,每6個月進行一次靈敏度檢測,其靈敏度在有效期內應符合規定。有研究表明,鱟試劑的靈敏度在符合標準規定及適當的貯存條件下,3年內其靈敏度變化不大,是穩定的。建議可適當延長其有效期。因此,對鱟試劑靈敏度進行監測性複核有利於確保實驗的準確性,同時可以最大程度地使用鱟試劑。
使用過程正確操作 選擇合適的操作方法與順序,在鱟試劑的使用過程中尤為重要。在操作過程中要注意以下幾點:(1)實驗室要求潔淨、無塵埃流通;檢驗人員同時注意衞生的保持。在整個使用操作過程中應防止微生物的污染,例如空氣的流動,人員的口沫、汗液污染等。(2)鱟試劑開啓、溶解和配製時應儘量避免將安瓿外瓶壁髒物、瓶壁碎片、砂輪鋸屑等異物混入鱟試劑中,避免鱟試劑外損。(3)鱟試劑中含有多種蛋白質,用力振搖會產生氣泡,一旦起泡難以消除,而影響檢測的準確性,所以在整個操作過程中都要輕力以避免因過分震動而引起的誤差。(4)量取和加樣反應物時,一定要加到試管底部接近鱟試液而不接觸鱟試液的管壁處。(5)生成凝膠的最適pH值為6~8,對於氯化鈉注射液、葡萄糖注射液(5%,10%)等注射液,不需考慮供試液的pH值,而檢查其他製劑時,尤其是一些本身緩衝能力較強或偏酸、鹼的供試品,應考慮供試品的pH值。(6)使用時要嚴格控制温度和時間。當鱟試劑一加入內毒素及樣品混合液中時反應已開始,並在一定的温度範圍內,反應温度越高,反應速率越大;保温時間的增長,也會提高鱟試劑的靈敏度,增加假陽性的發生,導致較大誤差。因此,要注意控制温度的變化和保温時間。(7)保持實驗器具的潔淨。每次檢驗完畢,應及時將玻璃器具充分清洗後於250℃乾熱滅菌處理,待烤箱温度升至設定的温度後開始計時,幹烤至少1h。也可用其他經確證不干擾細菌內毒素的檢查的適宜方法。對於塑料、橡膠等不耐熱器材可用30%雙氧水浸泡4h,用無熱原水沖洗,70℃乾燥備用。
鱟試劑的貯存
雖然凍乾的鱟試劑在常温條件下是相對穩定的,但還是應存放在2℃~8℃下,避免長時間放置在高於25℃的温度條件下導致因貯藏不當、質量下降而引起的檢驗誤差。
- 參考資料
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- 1. 鱟的血液 .海洋生物博物館-中國數字科技館[引用日期2016-07-29]
- 2. 劉昌庭.鱟試劑及其應用:中國現代藥物應用雜誌社,2008年5月第2卷第9期:110-111