極端酶

嗜極菌是天然極端酶的主要來源，生活在生命邊緣(高温温泉、海底、南北極、鹼湖和死海等)的嗜極菌，包括嗜熱菌、嗜酸菌、嗜鹼菌、嗜鹽菌、嗜冷菌、嗜壓菌和耐有機溶媒的菌類，體內需要有適應於生存環境的基因、蛋白質和酶類。因此從嗜極菌中可以篩選人們所需要的極端酶。在美國、日本、德國等地有20多個研究課題組正活躍於尋找嗜極菌及極端酶。按常規的極端酶篩選方法：從極端環境中採集樣品，富集，分離嗜極菌，再通過特定選擇標記篩選極端酶。用這種方法已經分離得到很多極端酶。但是人們對環境的認識仍有限，實際上大部分的嗜極菌還未被培養，因此限制了極端酶的開發。1994 年美國RBI公司(Recoinbinant Bio-catalysis Inc.)直接從極端環境中收集DNA樣品，隨機切割成限制性片段，再插入寄主細胞(E.coli 或 Bacterium等)進行表達，並篩選極端酶，RBI公司利用此法已經獲得175種新的極端酶，大大節省時間和金錢，提高了極端酶的篩選效率。 ^[1] 

一旦篩選得到極端酶的生產菌株，要使極端酶投入工業化應用，接着就是大規模的細胞培養和酶的大量合成及分泌條件的優化，生化反應設備的設計等工作。因此，各種超高温生化反應器，高靜壓生化反應器應運而生。儘管如此，要滿足嗜極菌的生長及發酵條件，將會對設備和環境提出苛刻的要求，設備腐蝕和破壞率大大提高。為了解決這一難題，科學家把極端酶的基因克隆到嗜温菌中表達。嗜鹼纖維素酶103的基因被克隆到芽孢桿菌中獲得成功表達，產物能很好地保持原有的穩定性，成果被應用在工業化生產，並在洗滌劑工業中使用，每年產量50-250噸。 ^[1] 

人們從嗜熱菌中已分離得到多種嗜熱酶(55-80℃)及超嗜熱酶(80-113℃)，包括澱粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶及DNA聚合酶等，在75-100℃之間具有良好的熱穩定性。同種嗜熱酶與嗜中温酶主要性質基本相同，熱穩定性不同主要是分子內部結構決定的，維持其內部立體結構的化學鍵和物理鍵，特別是氫鍵、二硫鍵的存在及數量與酶的熱穩定性有關。一般認為，當這些鍵存在及數量增加時，酶的熱穩定性增強；這些鍵斷開，則酶的熱穩定性降低或喪失。分子量較小的蛋白質一般比分子量較大的蛋白質有更大的熱穩定性。例如嗜熱棲熱菌的3-磷酸甘油脱氫酶分子量就較小，利於熱穩定。在芽孢形成過程中，由於芽孢桿菌的醛縮酶分子中有一部分與酶活性無多大關係的肽鏈被水解掉，從而使該酶的熱穩定性提高。嗜熱酶分子的許多微妙結構很可能與熱穩定性有關，例如稍長的螺旋結構、三股鏈組成的β-摺疊結構、C和N端氨基酸殘基間的離子作用以及較小的表面環等形成了嗜熱酶緊密而有韌性的空間結構，提高了熱穩定性。高温穀氨酸脱氫酶和檸檬酸合成酶的結構研究表明了離子作用在嗜熱酶中的重要性，嗜熱酶在離子偶聯的數量和程度上勝過嗜温酶，而且檸檬酸合成酶嗜熱酶還包括亞單位的相互作用和羧基端氨基酸殘基的作用。但是，高温穩定性和離子相互作用的正比關係並不是普遍存在的。Ca²⁺能提高許多熱穩定性酶的耐熱性，起到類似二硫鍵樣的橋連接作用，對穩定酶分子的三維結構有重要作用；鋅離子對某些耐熱酶也有熱穩定作用，把嗜熱脂肪芽孢桿菌編碼腺苷酸激酶的基因轉染給的大腸桿菌，分析所表達的蛋白質，可發現該腺苷酸激酶含有1個與4個半胱氨酸緊密結合的鋅離子，形成1個鋅指結構。如果用PMPS或者EDTA去除結合狀態的鋅離子，那麼該酶的變性温度從74.5℃降至約67℃。至於後者温度仍然比較高，是由於酶中存在大量的Arg和Lys殘基。嗜熱和超嗜熱的產甲烷菌體內的鉀離子和三陰離子環狀二磷酸甘油酯的濃度分別達到1.0-2.3 mol/L 和1.2 mol/L，這些含碳化合物對相應的離體酶具有穩定作用。

從嗜熱菌中分離出來的酶顯示了獨特性：具有極高的熱穩定性，能抵抗化學變性劑如表面活性劑、有機溶劑和高酸高鹼環境，其催化功能優於在各種工業生產中應用的酶。超嗜熱菌中存在一種逆促旋酶，它能夠誘導DNA形成正性超螺旋的typeI-5′拓撲異構酶。高熱穩定的澱粉酶用於生產葡萄糖和果糖，對改進工業澱粉轉化工藝非常有意義。已從嗜熱Thermotoga 中分離出一種超級嗜熱的木糖異構酶，這種酶能把葡萄糖轉化為果糖，這樣就能在高温條件下提高果糖的產量。一種高熱穩定普魯蘭酶能專一水解支鏈澱粉形成長鏈線性多糖；木糖酶用於紙張漂白；蛋白酶用於氨基酸生產、食品加工、洗滌劑、固定化製造天冬甜精；纖維素酶用於鑽探操作、促進石油或天然氣流入油井孔 。嗜熱菌有相對高的生長率 ，代謝快，世代時間短，酶的熱穩定性高，用於微生物發酵工程可減少污染、節約能量、降低成本、提高處理效果和產品質量。 ^[2] 

從嗜冷微生物中分離的嗜冷酶具有低温活性並且在常温下失活。例如來自南極細菌的α-澱粉酶，枯草桿菌蛋白酶和磷酸丙糖異構酶等。通過對嗜冷酶的蛋白質模型和X-射線衍射分析的結果表明，酶分子間的作用力減弱，與溶劑的作用加強，使具有比常温同工酶更柔軟的結構，使酶在低温下容易被底物誘導產生催化作用，温度提高，嗜冷酶的弱鍵容易被破壞，變性失活。對具有低温活性的檸檬酸合成酶結構分析表明，其活性部位的柔軟性來自於酶擴展的表面電荷環和酶表面上脯氨酸殘基的減少。嗜冷菌分泌的低温葡聚糖酶催化亞基上較小的氨基酸可以增加酶的柔韌性，活性與溶液的離子強度有關。較柔軟的活性中心可以更容易地進入底物，進行酶反應。另外嗜冷酶也必須進行結構調整以避免蛋白質的低温變性，通常是通過減少低温下的疏水相互作用。嗜冷菌編碼具有低温活性酶的基因也已經成功地表達，在0-2 ℃範圍內產α-澱粉酶的嗜冷菌的酶基因已經在大腸桿菌中表達，發現大腸桿菌必須在低於室温的條件下培養，才可使酶正確摺疊，避免酶的不可逆變性。

嗜冷菌在低温下即可對污染物質進行降解和轉化，分離自嗜冷菌的脂酶、蛋白酶及β-半乳糖苷酶在食品工業和洗滌劑中具有很大潛力。嗜冷鹼性蛋白酶應用於洗滌劑工業，可能改變傳統的熱水洗滌方式，節約能源。嗜冷乳糖酶和澱粉酶為乳品和澱粉加工提供了新的工藝，對保持食品營養和風味起着重要作用，低温發酵也可生產許多風味食品及減少中温菌的污染。從海洋冷適應的微生物中分離的生物活性物質可用於醫藥、食品等。生命起源於温度很低的海洋，有人提出冷適應的微生物與生命起源相聯繫。

嗜鹽酶多存在於中度嗜鹽的古細菌和極度嗜鹽的真菌中，從嗜鹽微生物中分離的極端酶可以在很高的離子強度下保持穩定性和活性，這對菌體的生長是極為重要的。氨基酸序列的分析比較表明嗜鹽酶蛋白質比普通的同工酶含酸性氨基酸更多，過量的酸性氨基酸殘基在蛋白表面與溶液中的陽離子形成離子對，對整個蛋白形成負電屏蔽，促進蛋白在高鹽環境中的穩定。X 射線晶體和同源性模擬分析揭示的三維結構表明這些酶的表面帶負電荷的氨基酸，可以結合大量水合離子，形成一個水合層，減少它們表面的疏水性，減少在高鹽濃度下的聚合趨勢。蛋白表面具有超額的負電荷是嗜鹽蛋白的一個顯著特性。

嗜鹽菌利用的碳源十分廣泛，其中包括難降解的有機物，加之其對滲透壓的調節能力較強，體內嗜鹽酶的適應能力較強，故將其應用於海產品、醬製品及化工、製藥、石油發酵等工業部門排放的含高濃度無機鹽廢水以及海水淡化等。海藻嗜鹽氧化酶在催化結合鹵素進入海藻體內代謝中起重要作用，對化學工業的鹵化過程有潛在的價值。同時還具有可利用的胞外核酸酶、澱粉酶、木聚糖酶等。有的菌體內類胡蘿蔔素、γ-亞油酸等成分含量較高，可用於食品工業；有的菌體能大量積累PHB，用於可降解生物材料的開發。 ^[3] 

極端嗜鹼微生物菌體內部的pH值接近中性，但是其胞外酶必須在極高的pH值環境中保持穩定和活力。嗜鹼酶中鹼性氨基酸的比率較高，尤其在分子表面，利於酶的穩定。日本報道了一種絲氨酸蛋白酶，在最適pH13的情況，可能是含酸性氨基酸少，而精氨酸與賴氨酸的比率高，在較高pH條件下酶本身仍帶靜電荷，從而具有穩定性 。嗜鹼菌纖維素酶103的基因克隆到芽孢桿菌中獲得成功表達，產物能很好地保持原有的穩定性。其它木聚糖酶、澱粉酶、環狀糊精葡萄糖基轉移酶、β-甘露聚糖酶等也能在中性細菌中加以克隆和表達。

嗜鹼菌的胞外酶具耐高鹼特性，可用於工業酶製劑生產，有降解天然多聚物的能力，用於處理鹼性工業污水，將鹼性紙漿廢液轉化為單細胞蛋白。其澱粉酶可用於紡織品退漿及澱粉作粘接劑時的粘度調節劑。

嗜酸菌分泌的胞外酶往往是相應的嗜酸酶。嗜酸菌不能在中性環境生長，可能是由於嗜酸菌細胞含較多酸性氨基酸，有大量H⁺環境，在中性pH時H⁺大量減少，以致造成細胞溶解。與中性酶相比，嗜酸酶在酸性環境的穩定性是由於酶分子所含的酸性氨基酸的比率高，尤其在酶分子表面。

嗜酸菌已廣泛用於低品位礦生物瀝濾回收貴重金屬、硫氫化酶系參於原煤脱硫及環境保護等方面。 ^[2]