膠原酶

膠原酶按其存在的方式不同可分為人體內源性膠原酶和藥用膠原酶兩種。人體內源性膠原酶是指人體內部本身所具有的膠原酶，如牙齦、觸膜等上皮組織和關節滑膜、椎間盤內都不同程度的存在着這種膠原酶，它在體內膠原蛋白的分解過程中發揮着不可或缺的作用。藥用膠原酶是指利用生物製藥的高科技手段從溶組織梭狀芽孢桿菌的發酵液中提取、純化並精製而得的白色或類白色無菌凍乾粉針生物製劑。

膠原酶（collagenase）是從溶組織梭狀細胞芽孢桿菌提取製備的，主要水解結締組織中膠原蛋白成分。當擬消化的組織較硬，內含較多結締組織或膠原成分時，用胰蛋白酶解離細胞的效果較差，這時可採用膠原酶解離細胞法。 膠原酶僅對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大。因此適於消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）或0.03%~0.3%。膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶，要根據所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。

1、膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細 胞，用於哺乳動細胞的分離。

2、膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織。

3、膠原酶Ⅴ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用於胰腺小島組織的分離，將結締組織分離成單個細胞。

4、膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。

膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製、消毒滅菌和儲藏。

注意：

因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。

鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配製。

1.將漂洗、修剪乾淨的組織剪成1~2mm3左右小塊

2.將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入30~50倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。

3.將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內，每隔3min振搖一次，如能放在37℃的恆温震盪水浴箱中則更好。

消化時間與組織的類別有關，對於某些腫瘤組織或其他較緻密結締組織，消化時間4~48h，對於容易消化的組織可以採用37℃震盪消化15~45min，也可以根據具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經搖動即成細胞團或單個細胞，可以認為已消化充分。上皮組織經膠原酶消化後，由於上皮細胞對此酶有耐受性，可能仍有一些細胞團未完全分散，但成團的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此，如無特殊需要可以不必再進一步處理。

4.收集消化液（有時含個別組織塊及沒有充分消化的組織碎屑則需用100目不鏽鋼網過濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者無血清培養液離心漂洗1~2次，去除上清，加培養液製成細胞懸液，接種培養瓶。