細菌生物被膜

細菌生物被膜廣泛存在於各種含水的潮濕表面上，例如食品、食品加工設備、自來水管道、工業管道、通風設備、醫療器械甚至病理狀態下的人體組織器官表面等，是由附着於惰性或活性實體表面的細菌細胞和包裹細菌的水合性基質所組成的結構性細菌羣落。細菌生物被膜是細菌粘附表面生活時所採取的一種生長方式，一般由多菌種構成。根據細菌在BF內位置不同可分為：遊離菌、表層菌和裏層菌。遊離菌與表層菌比較相似，它們相對容易獲得營養和氧氣，代謝通常比較活躍，菌體較大；而裏層菌被包裹於多聚糖中，其養料的獲取及代謝只能通過周圍的間質水道進行，代謝率較低，多處於休眠狀態，一般不進行頻繁地分裂，菌體較小。John R.Lawrence 等在研究生物被膜結構中應用激光共聚焦掃描顯微鏡技術首次發現BF 呈獨特的三維結構：細菌在生物被膜中只佔不足1/ 3，其餘部分均是細菌分泌的粘性物質和胞外多糖。BF 中水分含量可高達97%，除水和細菌外BF中還存在各種生物大分子如蛋白質、多糖、DNA、RNA和磷脂等。

據專家估計幾乎所有的細菌在一定條件下都可以形成生物被膜。沙門氏菌、大腸桿菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌等為易導致食源性疾病的常見病原菌，存在於空氣、水、灰塵或人和動物的排泄物中，食品受其污染的機會較多：食品加工人員、炊事員或銷售人員帶菌，造成食品污染；食品在加工前帶菌，或在加工過程中受到污染，產生毒素，引起食物中毒；熟食製品包裝不嚴，運輸過程中受到污染；禽畜屠宰前帶菌，也會對食品產生污染，且細菌易在食品、各種食品加工接觸面及非食品加工接觸面(如牆壁、下水道、死角等地方)形成生物被膜,再經手或空氣污染食品而引起食物中毒。生物被膜中細菌的代謝活動除了能夠腐蝕管道和金屬表面外，更可導致動植物及人類疾病發生。因此，控制食品中各種病原菌的污染，特別是防止其形成生物被膜交叉污染食品，可有效控制食源性疾病的發生 ^[1]  。

一般認為生物被膜的形成過程分為4 步:條件膜的沉積;細菌的初始到達及吸附;生長繁殖;生物被膜形成。當無菌的醫用植入器材(多為生物材料多聚物)植入體內之後, 其表面立即被唾液、血液、尿液及胃腸道內黏液等各種體液包圍,各種糖蛋白、粘多糖、金屬離子和其它成分會在數分鐘內滲透並吸附到其表面, 形成條件膜。條件膜象網一樣覆蓋基質表面, 使細菌到達時能夠“看見”膜的成分, 並進一步吸附其上。鈉、鎂等陽性金屬離子便常常作為帶負電的細菌和帶負電的物體表面(自然界多數表面都帶負電)連接的橋樑。細菌到達及吸附到生物材料表面的精確機制尚在研究之中, 已有數種理論提出, 其中包括Derjag uinLandau Verwey and Overbeck(DLVO)的膠體穩定理論和熱動力學理論。DVLO 理論描述了細菌到達物體表面過程中的力學變化, 並闡述了介質離子強度的影響。熱動力學理論則分析液相中的細菌到達固相基質表面的過程中自由能的變化。細菌濃度、存在時間、温度、流體力學、營養濃度及表面材料的理化性質等起着正或負的影響, 細菌表面鞭毛、菌毛等附加結構也影響生物被膜的形成。細菌到達並吸附表面之後, 開始生長繁殖並進一步擴散。擴散形式包括子細胞遷移、母細胞和子細胞同時遷移及滾動繁殖等3 種, 隨着細菌種類的不同而有所不同, 並影響生物被膜的結構形式。有報道表明, 細菌一到達物體表面, 其合成EPS的某些基因的轉錄活動就開始加強, 如綠膿桿菌是algC , algD , algU 的轉錄加強。細菌可能擁有接觸感覺來感知物體表面, 從而啓動特定基因的表達, 來合成EPS 。當細菌在EPS 的包裹下形成微羣落, 併為自己創造了一個能抵抗抗菌因子和宿主免疫機制的微環境時, 就表明成熟的生物被膜形成了。此時, 生物被膜能夠緩衝微環境的變化, 並通過羣落間隙獲得營養及排除廢物。並且, 它允許多種細菌組成共同體, 形成一個協同的環境, 其中一種細菌的產物可作為另一種細菌的基質成分。

細菌在吸附於物表後如何聚集成細胞羣落並協調其行為而形成生物被膜結構, 即細菌之間的信息傳導機制在進一步研究中。有研究表明, 細菌間存在着數量感知系統(quorum sensingsystems), 能夠感知到細菌數量的變化。酰化高絲氨酸內酯(acy lated homoserine lactones,AHLs)是革蘭氏陰性桿菌間傳導信息的物質之一, 它在生物被膜的最終形成中起着決定作用 。在表皮葡萄球菌中, 多糖細胞間吸附素(polysaccharide intercellular adhesin , PIA)和積累相關蛋白(accumulation-associated protein , AAP)則是兩種可能的信息傳導物質 ^[2-3]  。

細菌一般不在液體中形成生物被膜，但當含有營養成分的液體被細菌污染後，液體流經的物體表面（有無生物活性均可）就可以形成生物被膜。細胞沉積在固體表面以後，特殊的細胞表面結構（小纖維和聚合體）會將細胞與固體表面牢固的連接在一起。因此附着材料表面的粗糙度與生物被膜的形成密切相關，表面越粗糙越有利於細菌的粘附，可促進BF 的形成，反之，表面越光滑，粘附難以發生不利於BF 的形成。此外，附着材料表面的化學組成、臨界張力、表面能、親水/疏水性、表面電荷等對細菌黏附的影響也比較大，它們決定了血漿蛋白吸附種類，而這些蛋白是決定細菌黏附的重要因素。且附着材料表面有許多能與細菌細胞分子和元素髮生作用的結合位點，細菌通常粘附到有趨向濃縮營養物和表面產生刺激增生的自由能所在部位。Kristinsson 等用聚氨甲酸乙酯接枝其它親水性材料，使聚氨甲酸乙酯表面呈親水性，細菌粘附現象明顯減少 ^[1]  。

由於疫苗和抗生素的運用以及各種社會措施的採用, 由遊離細菌引起的大部分感染性疾病已經能夠較快地控制(多重耐藥菌株除外), 而由條件致病菌引起的感染則逐漸增多, 尤其在因為各種原因引起的抵抗力下降和運用插入性醫用裝置的人羣多見。這些感染常常與細菌形成生物被膜有關。病原菌包括革蘭氏陰性桿菌, 革蘭氏陽性球菌以及念珠菌, 表皮葡萄球菌, 綠膿桿菌和腸球菌尤為多見。生物被膜一旦形成, 就對抗生素及機體免疫力有着天然的抵抗能力, 用抗生素難以徹底清除, 而只能殺死生物被膜表面或血中導致感染髮作的遊離細菌。在機體抵抗力下降時, 生物被膜中存活的細菌又可以釋放出來, 重新引起感染。生物被膜猶如一個“菌巢” , 導致感染反覆發作, 遷延不愈, 形成慢性感染。插入性醫用器械相關的血液感染(device-related bloodst ream infection,DR-BSI)在醫院感染中極為常見, 尤其在ICU 中多見, 其危害嚴重, 應多加關注。

人體內的生物被膜可以對抗宿主免疫力, 對抗生素的敏感性也遠遠低於同種的遊離細菌, 其機理是多方面的。首先, 組成生物被膜的EPS 能阻礙抗生素或其它殺菌劑的滲透, 吸附並滅活部分抗生素水解酶(如β-內酰胺酶), 使進入生物被膜內部的抗生素有效劑量大大降低;同時,生物被膜對抗生素的阻礙, 也給細菌調節自身以抵抗抗生素提供了時間。其次, 生物被膜深處細菌常處於營養不足的“飢餓” 狀態, 生長緩慢甚至不生長。緩慢生長常常是細菌抵抗不利環境的策略之一, 此種細菌對抗生素的敏感性低於正常生長的細菌, 因為它至少可以抵抗從代謝途徑攻擊的抗生素。膜中細菌生長緩慢及對抗生素的高耐受性已經得到體外實驗證明。第三個原因可能是生物被膜內的部分細菌是天生的受保護的“生物被膜顯型” , 它不是對營養受限的反應, 而是對錶面生長的一種生物學反應。還有報道表明, 生物材料的化學組成也是影響抗生素對生物被膜的效果的重要因素。生物被膜對抗生素的抵抗, 也可部分解釋為何體外藥物實驗中敏感的抗生素,在體內治療時卻沒有療效。因此有人提出生物被膜清除濃度(biofilm elimination concent ration ,BEC)的檢測 , 但實際運用尚未開展 ^[2]  。

由於插入性醫用器械表面形成生物被膜幾乎不可避免, 相關的感染成為限制其廣泛使用的關鍵因素, 如何防止生物被膜形成就成為一個迫切的問題。首先, 要嚴格插管操作規程, 嚴格監護室管理, 儘可能縮短病人的住院時間, 以減少病人接觸和感染致病菌和條件致病菌的機會, 切斷生物被膜形成的細菌來源。用抗生素或其他化學殺菌劑包裹導管等醫用材料表面是常用的預防方法。但是用抗生素包被有很多缺陷, 它可能會誘導細菌耐藥性的產生, 廣譜抗生素的選用也受到限制。使用氯己定(洗必泰)等化學殺菌劑則難以控制其毒性, 可能導致嚴重的後果。關於金屬銀的應用研究較多, 研究表明, 銀包被的生物材料可以抑制革蘭氏陽性球菌, 革蘭氏陰性桿菌以及白色念珠菌生物被膜的形成。低濃度的銀也對人體無任何急慢性毒副作用, 也無致突變和致癌的作用。其體外實驗和臨牀實驗均在進行中, 有着良好的應用前景。但有人認為這些方法不能成功, 而應當採用相應的生物因子阻斷細菌纖毛或菌毛介導的粘附過程, 以及干擾細菌間的信息傳遞系統, 從而防止生物被膜的形成, 這可能是最有效的方法, 研究尚在進行之中。對於已形成的生物被膜來説, 物理方法是徹底清除的最有效途徑。對植入性醫用器械引起的感染, 取出和更換器械是最徹底的方法。超聲波可以通過成腔和起泡作用來清除生物被膜。通常抗生素清除生物被膜較為困難, 但也有可能找到穿透力特別強的藥物來清除某些種類的生物被膜。生物學控制是另一可能途徑。Hughes等曾分離出具有粘多糖降解酶的聚團腸細菌噬菌體, 可特異地降解聚團腸細菌產生的EPS ,進而破壞該生物被膜並溶解細菌。雖然由於該噬菌體不能降解其它種類細菌產生的EPS 而不能廣泛運用, 但它提供了一種方法可能性。複雜羣體中各種細菌相互間的影響也提供了一種控制生物被膜的思路。如減少牙菌斑中具核梭桿菌的數量, 就會顯著減少其中專性厭氧的Porphyromonasginivalis 和Prevotella nigrens 的數量, 提示生態學調節也可作為一種微妙的控制方法。

生物被膜形成及其相關感染是影響插入性醫用器械使用成功的關鍵。研究表明, 不同種類的細菌採用不同的“技巧”來接近和吸附物體表面,並定植其上, 生長繁殖, 最終形成生物被膜。成熟的生物被膜對抗菌素及其他化學殺菌劑有着很強的抵抗力, 一旦形成, 就較難清除。影響生物被膜形成的因素較多, 鞭毛、菌毛、數量感知系統、環境因子等的作用已經得到證實, 相應的控制措施也在研究之中。分子生物學技術的運用, 使研究更加深入。對生物被膜結構及形成過程的透徹理解, 必將有益於控制方法的研究從而最終找到徹底征服生物被膜相關感染的方法 ^[2]  。