海藻糖酶

海藻糖酶（trehalase）是葡萄糖苷酶（glucosidase）的一種，對海藻糖有特異作用，水解後成為2個分子的葡萄糖，EC3.2.1.28。廣泛存在於細菌、黴菌、植物和動物中。在人，除腎臟、腸、肝臟、膽液和尿以外，在血漿α2-球蛋白部分中，也可檢出其活性，特別是在腎臟中活性很強。

海藻糖酶是一種胞外酶，位於哺乳動物腎和小腸上皮細胞膜的刷狀緣，國際酶學編號為EC3.2.1.28，屬於水解酶類，它能催化水解一分子海藻糖生成兩分子葡萄糖，且底物作用是高度專一的。海藻糖酶的等電點為4.37，在正常體液pH7.4時帶有大量負電荷。該酶已從哺乳動物，腎臟中提純，經SDS-PAGE電泳顯示出一個75kDa的分子帶。海藻糖酶的cDNA已從家兔、人、和鼠組織中分離出來。人海藻糖酶cDNA完整序列顯示，該酶由583個氨基酸殘基組成，在氨基端含有一個由19個氨基酸殘基組成的典型的可切信號肽，在羧基端含有5個潛在的糖基化位點和—個疏水區。尿海藻糖酶通過糖基化磷脂酰肌醇連接於腎小管上皮細胞膜刷狀緣，需特異的磷脂酶C水解才能將其完全從上皮細胞膜釋放出來。

在腸道由海藻糖酶水解海藻糖生成的葡萄糖可能作為能源被吸收利用，有報道，缺乏海藻糖酶的患者在食了含大量海藻糖的蘑菇後引起腹瀉，而腎海藻糖酶的功能目前還不清楚。有報道説，尿海藻糖酶活性升高與近端腎小管損害和某些種類的腎疾病有關。

慢性腎小球腎炎、腎病綜合徵和慢性腎衰患者的尿海藻糖酶活性均升高。已有報道説，急性腎病綜合徵患者尿液NAG活性升高。這些作者得出結論：急性腎病綜合徵患者可能有腎小管損害。其他調查也顯示NAG活性升高和腎病綜合徵的復發有關。儘管腎小管損害患者尿NAG活性比對照組高1.5-5倍，而ELISA法測定的尿海藻糖酶蛋白濃度比對照組高6.2-200倍。

sasai-Takedatsu等也報告，在近端腎小管損害患者，尿海藻糖酶活性升高早於NAG活性升高。因此，腎小球疾病如急性期腎病綜合徵患者尿海藻糖酶濃度顯著升高暗示腎小管細胞已高度損害。急性期腎病綜合徵患者尿海藻糖酶蛋白含量比健康對照組高200倍，而緩解期患者與健康對照相比並不升高：沙門菌感染引起急性腎衰的患者尿海藻糖酶活性很低，但是用ELISA方法測定的麓蛋白的含最則顯著升高，是對照組的27倍，這可能是由於海藻糖酶的活性中心在爆發感染時被破壞而導致酶活性喪失。

有調查報告，在氯化汞誘導的腎中毒家兔和Itai-Itai病患者以及鎘污染區的居民，其尿液中海藻糖酶的活性均升高。另有人報道氨基糖甙類藥物妥布黴素和氨苄青黴素合用導致腎小管細胞損害，檢測尿海藻糖酶活性明顯升高，且早於NAG活性升高，其與肌酐的比值（T/Cr）大於NAG/Cr。

在腎小管性酸中毒、感染性或藥物性間質性腎炎、腎移植排斥反應等損害腎小管，尤其是近端腎小管的疾病，測定尿液中海藻糖酶可作為協助診斷、觀察病情及估計預後的一個靈敏而特異指標。

Lowe綜合徵是一種x一性連鎖隱性遺傳病。IshiharaR等報導Lowe綜合徵患者尿海藻糖酶蛋白含量比對照組高200倍。嬰兒型多囊腎為常染色體隱性遺傳性疾病，該病胎兒羊水中海藻糖酶含量明顯升高，測定該酶有助於早期診斷及優生優育。

1. 原理

利用海藻糖酶水解一分子海藻糖生成兩分子葡萄糖，然後測定生成的葡萄糖濃度作為海藻糖酶的活性濃度。

2. 步驟

將尿液標本0.5mL通過5mmol/LpH為6.2的磷酸鹽緩衝液平衡的SephadexG-25柱，以除去內源性葡萄糖。收集含蛋白的部分，將體積調整到1.5ml。將洗脱下來的標本0.9mI。加上0.1mL 0.25mmol/L的海藻糖，混合後於37℃温育120min。生成的葡萄糖用POD-GOD方法測定，以每小時每升尿液中釋放多少umol的葡萄糖量作為海藻糖酶的活性濃度。

3. 結果

IshiharaR等測定健康組尿海藻糖酶的活性是26.6±14”umol·h-1．gcreatinine-1。

1. 原理

利用抗海藻糖酶單克隆抗體的夾心ELISA方法檢測酶蛋白的含量。

2. 步驟

國外報導用重組海藻糖酶和人工合成的海藻糖酶多肽片段製備出抗人海藻糖酶的單克隆抗體，然後經過包被、封閉等步驟，用夾心ELISA方法測定出酶蛋白的濃度。

3. 結果

IshiharaR等用ELISA法測定健康組尿海藻糖酶蛋白的濃度為466±343ng·gcreatinin-1。健康實驗者的尿海藻糖酶活性和含量之間有正相關（p＜0.01，r=0.15）。這些數值均無性別及年齡差異。

海藻糖酶在正常人尿液中的活性很低，而且尿液中該酶活性是否能反映真實酶濃度也不確定。急性腎衰患者尿液中存在75kDa和30kDa酶蛋白分子，30kDa酶蛋白分子也許是蛋白水解酶降解完整海藻糖酶的產物，儘管尿液中存在75kDa酶蛋白分子，該患者尿海藻糖酶活性並不升高，説明尿液中酶活性已喪失，由於經典測酶活性方法的影響因素多而且靈敏度和特異性均不及免疫學方法測酶質量。因此，尿海藻糖酶的定量測定優於傳統的酶活性測定。

1. 人工海藻糖酶多肽片段的合成和重組海藻糖酶的製備

國外採用標準9-甲氧羰基熒光素固相合成法合成氨基酸殘基序列291-307肽段(SKDVEIADT~PEGDREA)。用反相高效液相色譜法（HPLC）分析並提純多肽。HPLC主要是根據分子的親水性（反相）和電荷（離子交換）方面的差別來實現樣品的分離的。反相HPLC的優點是分辨率大。利用分子生物學方法表達出的重組人海藻糖酶經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離純化後也可以作為一種免疫原。

2. 抗海藻糖酶單克隆抗體的製備

通過腹腔注射加佐劑的重組蛋白或合成的多肽來免疫8周齡的雌性小鼠BALB/c，第一次免疫問隔兩週後，每週連續注射3-4次。最後一次注射後3-4天殺死小鼠，用改良的Kohler和Milstein方法將脾細胞與B細胞瘤株P3-X63-Ag8融合。細胞融合產生8種雜交瘤克隆株：KM2275、KM2276、KM2285-2290，單克隆抗體KM2275和KM2276是由重組海藻糖酶免疫產生的抗體，其他抗體是由合成多肽免疫產生的。抗體KM2275和KM2287與重組海藻糖酶和尿液中的海藻糖酶均有良好反應。

3. 夾心ELISA方法的建立

用單克隆抗體KM2287包被ELISA反應板小孔，用生物素標記單克隆抗體KM2275，用HRP標記鏈黴親和索，採用生物素一親和素夾心酶免疫測定辦法；lshiharaR等測定了該方法的最適工作條件：尿液標本測定前需經凝膠過濾；尿液過濾後需用含1g/LSDS的PBS稀釋10倍；最適pH為6.0-8.0。當尿液貯存於-60℃、-30℃、或4℃30天，酶蛋白含量均未下降。可能影響的物質如維生素C（10g/L）、葡萄糖（100g/L）、白蛋白（10g/L）或肌酐（1g/L）均不影響該ELISA方法。

近年來的研究發現，腎小管-間質損害是決定腎功能減退的主要因素，而近端腎小管的損害義是腎功能惡化的重要原因。早期發現腎小管損害是錳牀診斷和治療的關鍵，而尿海藻糖酶在腎近端小管損害方面具有早期、特異、靈敏的診斷價值，目前國內實驗室尚未開展此項檢測，臨牀應用前景很大。當前首要的工作是用分子生物學方法制備出重組人海藻糖酶蛋白並加以提純，然後製備出抗海藻糖酶的單克隆抗體，繼而建立快速高效的ELISA檢測方法，使海藻糖酶的測定廣泛應用於臨牀檢驗工作，更好地為臨牀診斷服務。

通過抑制內源海藻糖酶水平來修飾海藻糖-6-磷酸水平從而調節代謝。

本發明在細胞代謝碳流調節領域內。已經發現導入細胞內糖類海藻糖-6-磷酸（T-6-P）有效來源的變化會誘導體內細胞、組織和器官的發育和/或組成的變化。這些變化可通過抑制內源海藻糖酶來誘導，該酶能夠將海藻糖水解成兩個葡萄糖組分。

通過抑制內源海藻糖酶水平來修飾體內細胞、組織或器官的發育和/組成的方法。

尿海藻糖酶與臨牀研究進展

腎臟疾病是嚴重危害生命健康的疾病，是世界衞生組織（WHO）所列的難治病之一，其發病率約佔人口的10%以上。屬常見病和多發病。

通過近年來對腎臟疾病的研究發現，腎小管一間質損害是決定腎功能減退的主要因素。因此，早期發現腎小管損害是臨牀診斷和治療的關鍵。

現今臨牀上用於診斷腎小管損害的物質有很多，主要分為兩大類：一類是腎小管細胞表面存在的許多特異性標誌物，當腎小管輕微損害時，這些標誌物脱落而從尿液中排出，常用的標誌蛋白有丙氨酸氨基肽酶（AAP）、N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶（NAG）、鹼性磷酸酶（AKP）、γ-谷氨酰轉換酶（GGT）等；另一類雖然不是腎小管的固有成分，但是尿液中這些物質增加往往提示腎小管的病變或損害，如β2-微球蛋白（β2-MG）、視黃醇結合蛋白（RBP）、α1-微球蛋白（α1-MG）等。

由於NAG、GGT、β2-MG、α1-MG、RBP等的分佈是非特異性的，除腎臟外，在其它組織亦有分佈，故其升高不能特異地定位於近端腎小管。此外，β2-MG、α1-MG和RBP在血中濃度較高，且分子量較小，它們在尿液中的濃度尚受血中濃度及腎小球濾過率的影響。由於尿海藻糖酶特異地定位於近端腎小管上皮細胞，而且在尿液中濃度極低，特異性及敏感性好。因此，在近端腎小管損害的早期診斷上，測定尿海藻糖酶是一種更理想的方法。