時間分辨熒光分析法

時間分辨熒光分析法（Time resolved fluoroimmunoassay,TRFIA）是近十年發展起來的非同位素免疫分析技術，是目前最靈敏的微量分析技術,其靈敏度高達10^(-12)g/ml ^[1]  ，較放射免疫分析（RIA）高出3個數量級。它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發光特點，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。由於其高靈敏度，在臨牀上得到了廣泛的應用，逐漸代替了放射免疫分析。 ^[1] 

在生物流體和血清中的許多複合物和蛋白本身就可以發熒光，因此使用傳統的髮色團進而進行熒光檢測的靈敏度就會嚴重下降。大部分背景熒光信號是短時存在的，因此將長衰減壽命的標記物與時間分辨熒光技術相結合，就可以使瞬時熒光干擾減到最小化。

時間分辨熒光分析法（TRFIA）實際上是在熒光分析（FIA）的基礎上發展起來的，它是一種特殊的熒光分析。熒光分析利用了熒光的波長與其激發波長的巨大差異克服了普通紫外-可見分光分析法中雜色光的影響，同時，熒光分析與普通分光不同，光電接受器與激發光不在同一直線上，激發光不能直接到達光電接受器，從而大幅度地提高了光學分析的靈敏度。但是，當進行超微量分析的時候，激發光的雜散光的影響就顯得嚴重了。因此，解決激發光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。

解決雜散光影響的最好方法當然是測量時沒有激發光的存在。但普通的熒光標誌物熒光壽命非常短，激發光消失，熒光也消失。不過有非常少的稀土金屬（Eu、Tb、Sm、Dy）的熒光壽命較長，可達1～2ms，能夠滿足測量要求，因此而產生了時間分辨熒光分析法，即使用長效熒光標記物，在關閉激發光後再測定熒光強度的分析方法。 　 平時常用的稀土金屬主要是Eu（銪）和Tb（鋱），Eu熒光壽命1ms,在水中不穩定，但加入增強劑後可以克服；Tb熒光壽命1.6ms，水中穩定，但其熒光波長短、散射嚴重、能量大易使組分分解，因此從測量方法學上看Tb很好，但不適合用於生物分析，故Eu最為常用。

由於常用Eu作為熒光標記，因此增強劑就成了試劑中的重要組成。增強劑原理：利用含絡合劑、表面活性劑的溶液的親水和親脂性同時存在，使Eu在水中處於穩定狀態。有些試劑，在絡合Eu在抗體上時已考慮了增強問題，而使用了具有增強作用的新絡合劑，因而有的試劑沒有單獨的增強劑。

隨着檢驗醫學的發展，對微量、超微量的測定會越來越多，同時RIA的污染問題會越來越被重視，因此，時間分辨熒光分析法（TRFIA）具有越來越大的應用空間。

標記離子的熒光激發光波長範圍較寬，發射光譜峯範圍窄，是類線光譜，這有利於降低本底熒光強度，提高分辨率。激發光和發射光之間有一個較大的Stokes位移，有利於排除特異熒光的干擾，增強測量的特異性。每一秒鐘檢測樣品1000次，結果取平均值，有利於提高檢測的準確性。

放射免疫分析(RIA)，以其高度特異性靈敏度和實用性，吸引着各國的生物醫學工作者，但操作中始終存在放射性污染、同位素半衰期短及試劑盒穩定性問題。為此，人們發展了一系列非放射性標記技術，如酶標記、化學發光、生物發光標記等技術，其中，時間分辨熒光免疫分析技術。由於靈敏度及線性範圍明顯優於其它技術，最為引人注目。

時間分辨熒光分析足以稀土離子標記抗原或抗體、核酸探針和細胞等為特徵的超靈敏度檢測技術，它克服了酶標記物的不穩定、化學發光僅能一次發光且易受環境干擾、電化學發光的非直接標記等缺點。使非特異性信號降低到可以忽略的程度，達到了極高的信噪比，從而大大地超過了放射性同位素所能達到的靈敏度，且還具有標記物製備簡便、儲存時間長、無放射性污染、檢測重複性好、操作流程短、標準曲線範圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應用範圍十分廣泛等優點，成為繼放射免疫分析之後標記物發展的一個新里程碑。

採用鑭系元素（銪、釤、鏑、鋱）進行原子標記，較鹼性磷酸酶、吖啶酯、生物素等大分子標記物優勢明顯：原子標記，標記物更多，檢測更靈敏，對被標記物的生物活性和結構無影響原子標記，標記穩定性強 多種標記，一個測試，多個項目。

標記離子螯合物產生的熒光強度高，壽命長，有利於消除樣品及環境中熒光物質對檢測結果的影響。每一秒鐘檢測樣品1000次，結果取平均值，有利於提高檢測的準確性。

靈敏度： 10-18 mol/well(Eu3+)

線性度： 10-18 ~ 10-12 mol/well(Eu3+) ^[2] 

1.激素：甲狀腺激素、甾體類激素。

2.病毒性肝炎標誌物。

3.腫瘤相關抗原醫學教|育網蒐集整理。

4.藥物。

5.多肽類。