piRNA

piRNA（Piwi-interactingRNA）是從哺乳動物生殖細胞中分離得到的一類長度約為30nt的小RNA，並且這種小RNA與PIWI蛋白家族成員相結合才能發揮它的調控作用。目前，越來越多的文獻表明piRNA在生殖細胞的生長髮育中的調控是由於Piwi-piRNA複合物引起的基因沉默導致的，但由於對piRNA的研究尚處於初級階段，它的一些具體的功能和生源論尚在研究當中。綜述了piRNA的最新研究進展。

生物體中RNA可以分成兩大類：編碼RNA和非編碼RNA。非編碼RNA中有許多種小RNA，在高等生物體內存在着大量的非編碼小RNA，它們組成了細胞中高度複雜的RNA調控網絡，在調節時序發育、細胞增殖、不對稱發育、樹突狀脊的發育、胚胎早期發育、腫瘤的發生發展、幹細胞分化及抗病毒等整個細胞水平的幾乎所有事件中起着重要的調控作用。

在非編碼小RNA的研究中，小干擾RNA（siRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）的研究起步較早、研究也較深入。siRNA是一類約21～25nt的RNA分子，由Dicer（RNAaseⅢ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成，通過完全互補配對的方式與目標mRNA結合，引起其降解，從而導致靶基因的的沉默。miRNA是一種長度為21～25nt的單鏈小分子RNA。它廣泛存在於真核生物中，成熟的miRNA，5′端有一個磷酸基團，3′端為羥基，它是由70～90個鹼基、具髮夾結構單鏈RNA前體（pre miRNA）經過Dicer酶加工而成，主要通過與靶標基因不完全互補結合，進而抑制翻譯或促進mRNA聚腺苷酸尾巴（polyAtail）的去除等方式調控靶基因的表達 ^[1]  [1]。但最近的相關研究發現，生物體內還存在與前兩種小RNA長度不同的另一類非編碼小RNA，它們的長度約為30nt，通過與Argonaute家族蛋白等結合來調控mRNA的穩定性、蛋白質的合成、染色質組織和基因組的結構。

2006年7月，Nature和Science等雜誌幾乎同時報道了一類新的非編碼小RNA，發現它們與生殖細胞發育密切相關[2，3]。最初，Aravin等 ^[2]  [2]發現了該種小RNA，他們在3個月大的C57BL/6J雄性小鼠中利用離心淘析技術從輸精小管中獲得了生殖細胞。從小鼠全睾丸組織的全細胞裂解液中進行了MILI核糖核蛋白複合體的免疫共沉澱分離了核酸，並利用親和方法純化了抗MILI-pepN2的抗體收集了一段多肽。從小鼠和人的睾丸總RNA中分離出的小RNA進行凝膠純化，克隆和測序。結果發現有兩種不同大小的小RNA：26～28nt30nt左右的RNA。為了鑑定不同的RNA類羣，他們克隆和測定了從睾丸中獲得的MILI interactingRNA和RNA，長度範圍在18～26nt和24～33nt之間。序列分析表明85%為MILIinteractingRNA，88%的是含有5′U嘧啶的24～33nt的RNA。基因組的聚類分析對應了1500多條MILIinteractingRNA的序列，根據在最大距離為15kb的兩個連續位點之間，表明有80%的克隆只來源於42個基因區，我們還發現，76%的這些序列確立了22～23nt的庫，也對應於相同的區域，這些區域也似乎同時產生了原本存在於睾丸總RNA中的26～28nt的MILIinteractingRNA和富含29～31nt的RNA。他們根據Piwi蛋白家族的成員MILI與這些小RNA的相互作用，命名為PiwiinteractingRNAs，即piRNAs。緊接着，Girard等 ^[3]  [3]在睾丸總RNA分離過程中也檢測到了這種小RNA，它與MIWI蛋白（一種鼠科的Piwi蛋白）結合。他們用小鼠17號染色體，大鼠20號染色體和人的6號染色體進行分析，發有類似的piRNA，大多數基因簇出現在同線位置上。此外，相繼有3篇文章也分別報道了在小鼠的生精細胞、生殖系細胞以及睾丸中發現了piRNA，其中日本的實驗室根據來源將其命名為germlinesmall RNA（gsRNA），由於命名原則的不同，故在名稱上存在一定的差異 ^{[4]  [5]  [6]}  [4～6]。

在果蠅中已經鑑定了5種Argonaute蛋白：Ago1，Ago2，Ago3，Piwi和Aubergine（Aub），其中Ago1和Ago2屬於Ago亞家族，是普遍表達的，而Ago3，Piwi和Aub屬於Piwi亞家族，它的表達具有種系特異性 ^[7]  [7]，Ago3，Piwi和Aub與非編碼小RNA的另一個成員———重複相關小RNA（repeatassociatedsmallinterferingRNAs，rasiRNAs）也存在相互作用關係 ^[8]  [8]。rasiRNA最初發現於果蠅和斑馬魚的胚胎髮育時期 ^{[9]  [10]}  [9，10]，最近又發現在果蠅的生殖系細胞中也存在 ^{[11]  [12]}  [11，12]，表達rasiRNA高度富集在睾丸和早期胚胎中。rasiRNA長度為22～24nt，與轉座因子、衞星和微衞星DNA以及Stellate重複抑制基因類似，它可能來源於長片段dsRNA的反義鏈，需要Dicer3（RNaseШ）催化，但沒有2′，3′末端羥基的特性。rasiRNA也與Piwi蛋白相結合可能在生殖細胞中沉默逆轉錄轉座子和重複元件來調節着果蠅的生殖系的發育，它的沉默機制可能與piRNA的調節方式存在一定的關係。

中國科學技術大學生命科學與醫學部和第一附屬醫院馮雪竹研究員和光壽紅教授課題組在《美國國家科學院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,PNAS）上發表了題為“A chromodomain protein mediates heterochromatin-directed piRNA expression”的文章。該研究以模式生物秀麗隱杆線蟲為模型，發現了在基因組上，異染色質化修飾能夠促進piRNA的轉錄生成，並且發現了一個全新的包含Chromo結構域的蛋白--USTC複合物結合依賴蛋白（UAD-2）參與調控異染色質化區域的基因轉錄。 ^[38] 

piRNA是一類長度為24～31nt單鏈的小RNA，大部分集中在29～30nt，與miRNA和rasiRNAs一樣，5′端也具有強烈的尿嘧啶傾向性（約86%）。雖然rasiRNA和piRNA的大小相似，但有兩點不同：首先，piRNA以高度特異鏈的方式對應於基因組，相反，rasiRNA在有義或反義定位之內對應於重複區域，它們似乎是由長dsRNA前體隨機產生的。其次，piRNA主要對應於單鏈基因組位點，但是rasiRNA是通過定義可轉座元件在內的重複位點來對應的。piRNA的表達具有組織特異性，調控着生殖細胞和幹細胞的生長髮育，目前只在老鼠[2～6]、果蠅 ^[13]  、斑馬魚 ^[14]  等動物的生殖細胞中發現了這類小分子。

piRNA在染色體上的分佈極不均勻，在小鼠中它們主要分佈於17、5、4、2號染色體上，而很少分佈於1、3、16、19和X染色體上，基本不分佈於Y染色體上[4]。另外，piRNA主要存在於基因間隔區，而很少存在於基因區或重複序列區。它們主要成簇分佈在1～100kb相對較短的基因組位點，且包含有10～4500個小分子RNA ^[15]  [15]。由於piRNA成簇分佈，且每一個幾乎都具有同一取向，説明同一簇piRNA可能來源於同一長初始轉錄物，但有一部分成簇的piRNA會突然改變取向，説明這些雙向的成簇piRNA可能由相同的啓動子按不同的方式轉錄而來[15]。

研究表明，piRNA主要存在於哺乳動物的生殖細胞和幹細胞中，通過與Piwi亞家族蛋白結合形成piRNA複合物（piRC）來調控基因沉默途徑。對Piwi亞家族蛋白的遺傳分析以及piRNA積累的時間特性研究發現，piRC在配子發生過程中起着十分重要的作用。經過研究人員分析發現，只有17% ～20%的哺乳動物piRNA對應於標記的重複序列，包括轉座子和逆轉錄轉座子[15]。因此，piRNA從後生程序化和抑制轉錄到轉錄後調控可能會有不同的功能。根據Piwi蛋白已知的功能推測piRNA的功能可能有3個方面 ^{[16]  [17]}  [16，17]。

在果蠅中的研究已經表明Piwi和rasiRNA的作用是沉默重複元件。在裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）中，小RNA和RNAi途徑涉及到了轉錄基因沉默（TGS）。在研究哺乳動物中TGS的因子時，純化得到了一個包含小RNA和Riwi的複合物（與人類Piwi同源），該複合物稱為piRNA複合物。它的製備物中包含rRecQ1，與脈孢菌（Neurospora）qde-3基因的表達蛋白同源，而該基因參與沉默途徑。因此推斷，哺乳動物的piRNA可能在TGS中起作用[6]。

在果蠅中，一個asyetuncloned異染色質基因的功能性等位基因flamenco能抑制內源性逆轉錄酶病毒gypsy。Piwi突變體，是已經知道的影響RNA介導的同源決定的轉基因沉默，也説明了在限制性的雌性生殖腺中阻斷gypsy的抑制作用。因此，推斷piRNA的功能和Piwi蛋白密切相關，具有Piwi依賴性 ^[18]  [18]。又發現，在flamenco敲除突變體中成熟piRNA的表達水平大量地減少[13]，而在Piwi敲除突變體中gypsyRNA的表達水平卻增加了150倍[18]，這些結果説明Piwi蛋白結合的piRNA的功能是維持轉座子沉默。

在另一項研究中發現了果蠅中存在的一種AubassociatepiRNA的沉默機制 ^[19]  [19]。Aub突變體導致了卵巢和睾丸中的逆轉錄轉座子的積累，以及睾丸中的Stellate轉錄物的積累。在卵巢中AubassociatepiRNA來源於包括逆轉錄轉座子在內的基因間的重複元件。而在睾丸中的Aub也聯合着不同的piRNA。大多數piRNA與Stellate抑制基因轉錄本的反義鏈對應，Stellate是已知的關於基因沉默的基因，另一個富含的種類是由來自X染色體和與vasa轉錄本高度互補的序列組成。這是首次以生物化學的觀點提出了由Aub和piRNA介導的沉默機制。

Piwi是一個表觀遺傳調控因子，起着調節生殖幹細胞維持的作用 ^[20]  [20]。Polycombgroup（PcG）蛋白可以維持關鍵的發育調節因子。在果蠅中，PcG與PcG反應元件（PREs）結合沉默持家基因。在果蠅基因組中，Piwi與PcG蛋白體共定位簇集成PcG反應序列 ^[21]  [21]。這樣，一些Piwi有關的piRNA可能與表觀遺傳調控有關。研究人員在果蠅中檢測了關於RNA積聚而假定的RNA沉默機制的效果。這些積聚的RNA包括不同的gypsy序列並報道了沉默的效果確實是與存在於卵巢中25～30nt長度的有義RNA的數量有關。實驗結果發現rasiRNA對gypsy轉錄本的有義鏈有下調作用 ^[22]  [22]，而且，在雄性生殖系中，Piwi蛋白能夠阻止逆轉錄轉座子的轉錄 ^[23]  [23]。這樣證據表明一些piRNA可能與後生調控有關。

Piwi亞家族主要有3個成員，分別是MIWI，MILI和MIWI2，是生殖系細胞中的特異性蛋白 ^{[24]  [25]}  [24，25]，與精子的發生有非常密切的關係，敲除Miwi，Mili或Miwi2基因，都會造成小鼠精子產生明顯缺陷，表現為雄性不育 ^[26]  [24～26]。MILI在早期的精子發生時表達，即從精原細胞的有絲分裂到精母細胞的粗線期，缺失MILI的小鼠則停止在粗線期；MIWI的表達則要晚一些，從粗線期到球形精細胞期，基因敲除的MIWI會導致精子發生停止在球形精細胞期。而基因敲除的MIWI2的小鼠在減數分裂早期有減數分裂進展的缺陷，並且生殖細胞隨着齡期有顯着的損失[25]。MIWI2突變體中生殖細胞表型的損失，和果蠅中Piwi突變體一樣，證明了小鼠中的MIWI2和果蠅中的Piwi在維持生殖系和幹細胞時起着類似的作用。

儘管piRNA的具體功能還未完全弄清，但是生殖細胞中的piRNA富集現象和Miwi突變種的雄性不育表明了piRNA在配子發育的過程中起重要作用，並且可能參與配子發生過程中基因表達模式及染色體組結構的調節。

Wilson等 ^[27]  [27]在果蠅胚胎髮育時發現aub在osker翻譯時有很重要的作用。儘管aub突變體似乎沒影響oskermRNA或Osker蛋白的穩定性，但在這突變體中Osker蛋白表達量卻明顯地減少了。Megosh等 ^[28]  [28]對果蠅中的Piwi蛋白研究發現，Piwi的減少不能影響Osk和Vasa蛋白的表達但能導致極質維持和原始生殖細胞（PGS）形成的失敗，而增加Piwi蛋白的表達量能提高Osk和Vasa蛋白的水平，也相應成比例地提高PGS的數量。由此推斷，Piwi和Aub在果蠅胚胎髮育時的翻譯可能具有正調節作用。同樣Miwi也可能促進睾丸中精子形成時一種主要調節子（CREM）的穩定性和目標mRNA翻譯的穩定性 ^[29]  [26，29]。

piRNA發現後，這類小RNA的來源一直是研究人員的研究重點之一。piRNA簇的鏈的強偏向性説明了它們可能產生於單鏈的前體，為了支持這個觀點，EST分析和RT、PCR實驗都顯示了假定的初始轉錄本，但是在反義轉錄本中卻未檢測到[5]。與miRNA前體不同，覆蓋有piRNA克隆的區域沒有摺疊入莖環結構。因此，piRNA的生物發生途徑明顯不同於miRNA和siRNA。儘管之前的研究表明人類的Piwi蛋白能夠與Dicer酶相互作用 ^[30]  [30]，但並沒有確定piRNA生物發生過程中是否與RNAaseIII如Dicer和Drosha有關。為檢測Dicer酶的必備條件，研究人員將攜帶有純合子dicer突變體的生殖細胞放在dicer野生型細胞的周圍。然後，從這些動物精巢中分離純化發現了標準水平的piRNA，這強有力地説明了piRNA的生物發生是與Dicer無關的[14]。

研究人員提出了幾種可能的piRNA生源論機制[2，5]：（1）長距離dsRNA結構可能形成了前轉錄物，它能夠解釋piRNA鏈的偏向性；（2）反義轉錄物可能以很低的水平表達來避免檢測；（3）前轉錄物可能由ssRNA-directed未識別的酶消化；（4）piRNA可能來源於由逆轉錄轉座子的逆轉錄酶產生的RNA-DNA雙鏈體。

在果蠅和斑馬魚的研究中提出了Piwi蛋白作用的piRNA 的生源論機制[12～14]。Gunawardane等[12]在果蠅卵巢中免疫純化了Aub和Ago3，並且分析了結合有不同Piwi蛋白的小RNA的序列。發現Piwi關聯的RNA與果蠅基因組中缺失的轉座子元件相對應。他們預測了與siRNA或miRNA相似的加工機制，首先在piRNA的兩條鏈的3′端由RNaseIII產生的2nt的懸突，即piRNA的兩條鏈在5′端的23nt處切割（假定piRNA的平均長度為25nt）。他們繪出了piRNA5′端和5′近鄰端的反義鏈的距離，根據預測的23nt的峯值處，發現piRNA5′端的互補鏈經常是在10nt處切割的，還發現piRNA在Ago3和Aub複合體中有很強的互補關係。在piRNA兩條鏈中的10nt的重疊促使了Piwi蛋白在piRNA的生物發生中起作用的假説。因此，提出了一個ping?pong模型（圖1） ^[31]  [12，31]：一個反義piRNA，衍生於絡合有Aub或Piwi的piRNA基因座，能識別和分離有義鏈的轉座子轉錄物。這個分離事件發生在反義piRNA相對的10～11nt的位置，從原初piRNA末端的相反鏈上，產生了一個距5′端長度為10nt的片段。分離的產物將裝載入第二種Piwi蛋白家族，根據觀測鏈的偏向性很可能是Ago3，與Ago3相關的piRNA在位置10處有很高的腺嘌呤百分比例。最終，經3′端未知的機制加工後成為新的piRNA。

圖1平pongmodelofpiRNAbiogenesis 小稿的piRNAs產生轉座子監管區域的heterochromatin.These piRNA既Piwi和Aubareantisense sassociated，轉座子轉錄和補充，它可以觸發放大loop.Piwi /奧布劈開明欣獲得轉座子比錄tween10和11新台比反義piRNA 5'端，隨後產生piRNA.Ago3職能另一個切片機，它可以識別piRNA clustertranscripts Ago3相關的意識，然後產生更多的Piwi / Aubassociated一tisense鏈piRNAHouwing等[14]在研究斑馬魚中的piRNA時發現，piRNA簇集與所有的GypsyDR1和GypsyDR2的位點有義鏈匹配，也是缺少U的偏向性。相反，如前面所述，在10nt位置富含A。這説明了進化的保守不僅是piRNA生物發生的策略，還是轉座子調控的一種生物化學途徑。

先前的文獻表明哺乳動物的piRNA在3′端的2′O甲基化。piRNA的生物合成機制和修飾功能仍舊不清楚。Kirino等 ^[33]  [32]報道了植物miRNA2′O甲基轉移酶HEN1在小鼠中的同源蛋白mHEN1，它在體外培養的睾丸中特異性表達並且使piRNA的3′端發生了甲基化，而HEN1在果蠅中的同源蛋白Pimet則介導了piRNA3′端的2′O甲基化作用 ^[34]  [33]。Iguchi等 ^[35]  [34]在研究小鼠中的兩種蛋白（MSY2和Translin）時發現，包含有Nct1和Nct2的一段序列與piRNAs的序列相同，並檢測到它們主要存在於精母細胞的粗線期。此外，還發現在精子發生進行時，單一拷貝的piRNAs，gsRNA10（其序列與在Nct1的29nt相同）的增加伴隨着Nct1和Nct2的減少，因此提出了Nct1和Nct2是piRNA前體的一部分。這些結果對piRNA的生源論研究提供了很好的理論基礎。

印度科學家SaiLakshmiS及其合作者建立了一個piRNA數據庫———piRNABank，以保存新發現的piRNA序列。piRNABank是一個高度用户友好的資源，它收錄了包括人、小鼠和大鼠的近2000萬個piRNA相關序列，經過同源序列去除、基因組定位等篩選，最近得到10萬多個在基因組中具有唯一靶位點的piRNA序列。數據庫支持物種和染色體方式的多種的搜索方式，包括登錄號、染色體定位、基因名或符號，基於同源性的序列檢索，簇和相應基因及重複元件。它也可以在基因組大圖譜上顯示每個piRNA或piRNA簇。數據庫內的信息也將隨着新的研究進行不斷更新，果蠅和其它物種的piRNA信息也將會被收錄，作者還計劃增加一些序列和結構預測的軟件，更方便科研人員使用 ^[36]  [35]。

piRNA的發現為非編碼小分子RNA的研究開闢了一個新領域，被Science評為2006年十大科技進展之一 ^[37]  [36]。到目前為止，piRNA的研究已經取得了階段性的成果，但要預測piRNA在生物醫學上的應用還為時過早。其中仍然有許多問題需要進一步研討，如piRNA的序列在不同物種中的同源保守性還不好分析；在piRNA生源論中，仍舊不知道3′端的分裂機制和piRNA擴增循環是如何調節的。另一個尚未解決的問題是piRNA在特異位點表達的結果所產生的功能以及piRNA3′端甲基化的機制還沒有弄清楚。piRNA和Piwi蛋白在後生調控中起的作用很可能大於轉座子沉默的作用，實驗室研究非生殖器官Piwi蛋白高表達組織中，piRNA的克隆及調控作用，但尚未取得有意義的進展。

因此，piRNA的研究不僅可以豐富小分子RNA的研究內容，同時，也有利於進一步瞭解生物配子發生的分子調控及其機理，具有十分重要的理論價值和應用前景 ^[32]  。