bcr/abl融合基因

由t (9；22) (q34；q11)產生的費城染色體(Ph)在血液腫瘤中具有重要的診斷和預後意義，出現於90%以上的CML、30%成人ALL、2%~20%兒童ALL以及少數AML和MM患者。位於9q34的ABL基因與位於22q11的BCR基因相互易位，形成BCR/ABL和ABL/BCR融合基因。BCR/ABL融合基因是一種抗細胞凋亡的基因，具有高度酪氨酸激酶活性，激活多種信號傳導途徑，使細胞過度增殖而使細胞調控發生紊亂。BCR基因有兩種斷裂位點，在CML中幾乎都為M-BCR位點，而在ALL中大約2/3位m-BCR位點。具有BCR/ABL融合基因的患者預後差，臨牀上可以根據患者是否存在BCR/ABL融合基因來選擇性地使用分子靶向治療藥物。FISH方法檢測BCR/ABL融合基因具有極高的靈敏度和檢測隱匿型易位的能力 ^[1]  。

CML第9號染色體上c-ABL原癌基因易位於第22號染色體上BCR基因區域，形成1個新的5'BCR-ABL3'融合基因。後者可轉錄8.5kb的mRNA，含3.3kb BCR的編碼序(5'端)和5.5kb ABL的編碼順序(3'端)8.5融合mRNA中BCR-ABL的閲讀框架仍保持。可以翻譯成1條210KDa的蛋白質，包括ABL編碼的1104個氨基酸殘基和BCR編碼的920個氨基酸殘基。在體外有較強的酪氨酸蛋白激酶活性。Goldman實驗證實，BCR-ABL融合基因具有致癌作用。此外一些作者還證實在體外細胞培養中能使造血多能幹細胞發生轉化。這些新的研究成果肯定了斷在白血病發病機制中的重要作用 ^[2]  。

BCR斷裂點的異質性，決定了BCR/ABL產物的分子異質性。98%CML的BCR斷裂點在ber(bcr﹣)，主要在BCR14附近3kb區域內。由此形成的BCR/ABL，表達8.5kbmRNA蛋白。5.8kb bcr區域是BCR基因的一部分，包括12、13、14和15號4個外元及相應的內元。絕大多數斷裂點位於14號外元上游，則 BCR-ABL融合基因包含BCR1~13號外元；如斷裂點位於14號外元下游，則14號外元也包含在融合基因中。在很少情況下15號外元也包含在內(5區)由於轉錄後mRNA的剪接作用雖然融合基因有14號外元，但最終表達產物也可能丟失它 ^[2]  。

人abl基因位於9號染色體長臂，有1b、1a和2～11共12個外顯子。轉錄始自1b或1a，形成的兩種mRNA長度分別為7kb和6kb，合成的兩種蛋白質分子量均約為145，前者定位於細胞膜，而後者主要在細胞核內。abl主要結構有N端的肉瘤同源2(srchomology，SH2）、SH1。SH2結合磷酸化的酪氨酸殘基，SH1具有酪氨酸激酶活性。近C端富含酸性氨基酸殘基，可結合DNA。abl蛋白參與細胞週期調節。在G0期，abl-Rb蛋白複合物與DNA結合。在G1→S轉變過程中，Rb被磷酸化，abl與之分離，並激活，使RNA聚合酶磷酸化，促進轉錄，細胞進入S期。bcr基因位於22號染色體長臂，有23個外顯子。蛋白產物分子量均為160。bcr蛋白第1～63個氨基酸是二聚體化結構，參與bcr蛋白多聚體的形成。bcr蛋白參與細胞週期調節，但詳細過程還不十分明確。

bcr基因斷裂點集中在三個區域：主要(major bcr，M－bcr）、次要（minor bcr，m－bcr）和μ（μ－bcr）區域。abl基因斷裂位於第1或第2內含子。因斷裂點不一，bcr/abl融合基因及其mRNA和蛋白產物呈多樣性。慢性粒細胞白血病的bcr基因斷裂點常位於M-bcr，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量為210kb。

90%以上的CML患者的血細胞中出現Ph1染色體，t(9；22)(q34；q11），9號染色體長臂上C-abl原癌基因易位至22號染色體長臂的斷裂點集中區（bcr），形成bcr/abl融合基因。此基因產生一種新的mRNA，編碼的蛋白為P210，P210具有增強酪氨酸激酶的活性，改變了細胞多種蛋白質酪氨酸磷酸化水平和細胞微絲機動蛋白的功能，從而擾亂了細胞內正常的信號傳導途徑，使細胞失去了對周圍環境的反應性，並抑制了凋亡的發生。Ph1染色體和bcr/abl融合基因是CML的分子基礎，並可作為區分典型CML和非典型CML的診斷指標。依據Ph1染色體和bcr/abl融合基因，可將CML分為3類，第1類為Ph1陽性和bcr/abl陽性，其臨牀表現為外周血象白細胞升高，以骨髓粒細胞極度增生為主；第2類為Ph1陰性而bcr/abl陽性，這是一組異質性疾病，實際上屬於Ph1陽性的CML範疇；第3類為Ph1和bcr/abl均陰性。前兩者具有相同的臨牀表現和血液學特徵，為典型的CML，後者為非典型CML。正確區分對臨牀治療判定預後有一定的指導作用。

即DNA印跡，可以對bcr-abl融合基因DNA重排進行分子生物學檢測。將經限制性內切酶酶切及瓊脂糖電泳分離的DNA片段轉移到固相雜交膜上，胚系DNA會產生特徵性片段，但發生過基因重排的細胞DNA因酶切位點有所改變會產生有別於胚系的DNA酶切片段。大多數bcr基因的斷裂點集中於5.8kb的主要斷裂點集簇區（M-bcr）。從白血病患者白細胞中抽提的基因組DNA，經一組限制性內切酶消化及瓊脂糖凝膠電泳分離後轉移到尼龍膜上，用取自M-bcr3’和5’端的bcr探針與之雜交。放射自顯影洗片後即可顯示所要檢測的條帶，對於CML患者，除可見到一條與胚系bcr基因組DNA相對應的條帶外，其他的條帶説明存在重排的bcr等位基因。

採用異硫氫酸胍酚、氯仿一步法提取細胞總RNA，用RT-PCR技術擴增bcr-abl基因接合區mRNA是檢測CML敏感而特異的方法，設計兩對引物，先進行逆轉錄反應合成cDNA，再進行PCR擴增，取擴增後產物10μl，用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，在紫外燈下觀察結果。

PCR擴增時，加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針。該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收。PCR擴增過程中，Taq酶的5’～3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而使熒光檢測系統接受到熒光信號。每個模板的Ct值（即每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數）與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關係，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中縱座標為起始拷貝數的對數，橫座標代表Ct值，然後根據待測樣本的Ct值從標準曲線上計算出該樣本的起始拷貝數。

另外bcr/abl融合基因編碼的蛋白P210可以用Western印跡或酶聯免疫反應加以檢測。

CML治療的目的是控制血液學和遺傳學異常、消除症狀、最大限度地延長生存。

既然酪氨酸激酶在CML的發生中起了關鍵作用，抑制其活性成為CML治療的一個新途徑。已經合成了較特異的abl酪氨酸激酶抑制劑，即STI-571（伊馬替尼，格列衞）。伊馬替尼是2-苯氨嘧啶衍生物，它可以選擇性地阻斷ATP與Abl激酶結合位點，有效地抑制bcr-abl激酶底物中酪氨酸殘基的磷酸化，使該酶失活，進而阻止了一系列的信號傳導。伊馬替尼也抑制c-kit（幹細胞因子）和PDGFR（血小板衍化生長因子受體）的酪氨酸激酶活性。實驗表明，伊馬替尼不殺傷bcr-abl- 細胞，只殺傷bcr-abl+ 細胞。該藥選擇性抑制CML患者粒細胞-單核細胞集落形成單位（CFU-GM) 和爆式紅系集落形成單位（BFU-E）的生長，使骨髓或外周血單個細胞半固體培養中集落形成率降低92%～98%，對正常集落的形成沒有影響。伊馬替尼通過抑制bcr-abl活性，使得參與細胞週期、粘附骨架形成等生理過程的多種基因轉錄發生改變，引起bcr-abl+ 細胞分化、凋亡。

機體抗腫瘤免疫的機制包括細胞免疫和體液免疫兩方面，對CML主要以細胞免疫為主。CML對免疫治療有效，包括INF-α、造血幹細胞移植和供者淋巴細胞輸注（DLI），其機制為T細胞和其他免疫效應因子的參與。INF-α通過和細胞膜受體結合，激活大量信號傳導途徑，調控相應基因轉錄，抑制白血病細胞增生、促進凋亡。另外干擾素還可通過免疫調節，增加染色體陽性細胞HLA分子的表達量，結合的白血病肽段可更有效地被抗原呈遞細胞和T淋巴細胞識別，增加NK細胞和細胞毒性T細胞功能，從而殺傷白血病細胞。

異基因造血幹細胞移植能根除Ph+ 克隆，恢復正常造血，使大部分CML患者真正達到治癒。因而仍認為治癒CML的唯一方法是異基因造血幹細胞移植。許多因素可影響異基因移植的效果，如患者性別和年齡、移植時所處的病期、供者來源（相關或不相關）、組織相容性及從診斷到移植的時間等。

既往經驗表明，當病情進展到加速或急變期後實施異基因SCT後效果不佳，多數專家主張應在慢性期移植，結論是CML診斷後儘早（一年內）移植。

有不同觀點，德國CML協作組的研究顯示移植前停用IFN3個月以上再做移植，與從未用過IFN的病人做移植的效果相同；移植前3個月內用IFN則增加移植相關死亡率。

與骨髓相比，外周血採集物含有更多的CD34+ 細胞和10倍以上的淋巴細胞；移植後中性粒細胞和血小板的恢復均較快；慢性移植物抗宿主病（GVHD）的發生率較高和程度較重；移植後白血病複發率較低。

去除供體的T細胞可預防GVHD，其代價為移植物被排斥率增加，免疫重建延遲、複發率增加。對去T細胞移植後預防性的輸注供體源的T細胞可降低複發率。

HLA相合的同胞供體仍是最佳選擇。其它可供選擇的有HLA相合或大部分相合的親屬供體、HLA相合的無關供體，HLA相合或大部分相合的臍帶血。非同胞間的配型須採用分子生物學方法。一般説來，HLA相合同胞間移植的效果優於無關供體移植。

慢性期移植後5年內複發率為0～30%，主要取決於移植方案和GVHD預防方式。去T細胞處理、GVHD預防力度強和進展加速期移植者複發率高。

造血幹細胞移植可使大部分CML患者獲得治癒，但仍有少數病例會出現復發，DLI為復發的治療提供了新的方法。異基因造血幹細胞移植能治癒經選擇的CML患者，其治療作用依賴於移植物抗白血病作用，疾病復發後DLI可以重新誘導出現移植物抗白血病作用，並增強此作用，從而通過增強免疫治療控制疾病復發。