革蘭染色法

革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑑別染色法，1884年由丹麥醫師、細菌學家Christain Gram創立。

細菌先經鹼性染料結晶染色，而經碘液媒染後，用酒精脱色，在一定條件下有的細菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把細菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），後者為革蘭氏陰性菌（G—）。為觀察方便，脱色後再用一種紅色染料如鹼性蕃紅、稀釋復紅等進行復染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應；弧菌，螺旋體和大多數致病性的無芽胞桿菌都呈現負反應。革蘭氏陽性菌對青黴素敏感，革蘭氏陰性菌對鏈黴素敏感。可根據革蘭氏染色法鑑別不同菌種並對症下藥。

革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學組成和生理性質上有很多差別，染色反應不一樣。現在一般認為革蘭氏陽性菌體內含有特殊的核蛋白質鎂鹽與多糖的複合物，它與碘和結晶紫的複合物結合很牢，不易脱色，陰性菌複合物結合程度低，吸附染料差，易脱色，這是染色反應的主要依據。另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進行染色，陽性菌吸附鹼性染料很多，因此不易脱去，陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴格控制。例如，在強鹼的條件下進行染色，兩類菌吸附鹼性染料都多，都可呈正反應；PH很低時，則可都呈負反應。此外，兩類菌的細胞壁等對結晶紫—碘複合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脱色，陰性菌透性大，易脱色。所以脱色時間，脱色方法也應嚴格控制。 ^[1] 

G﹢菌：細胞壁厚，肽聚糖網狀分子形成一種透性障，當乙醇脱色時，肽聚糖脱水而孔障縮小，故保留結晶紫-碘複合物在細胞膜上。呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯鬆散，乙醇脱色不能使其結構收縮，其脂含量高，乙醇將脂溶解，縫隙加大，結晶紫-碘複合物溶出細胞壁，番紅染液復染後呈紅色。

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

（1）載玻片固定。在無菌操作條件下，用接種環挑取少量細菌於乾淨的載玻片上塗布均勻，在火焰上加熱以殺死菌種並使其粘附固定。

（2）草酸銨結晶紫染1分鐘。

（3）自來水沖洗，去掉浮色。

（4） 用碘-碘化鉀溶液媒染1分鐘，傾去多餘溶液。

（5）用中性脱色劑如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革蘭氏陽性菌不被褪色而呈紫色，革蘭氏陰性菌被褪色而呈無色。

（6）用蕃紅染液復染30秒，革蘭氏陽性菌仍呈紫色，革蘭氏陰性菌則呈現紅色。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌即被區別開。 ^[1] 

1、塗片太厚 在塗片時細菌挑的太多，沒法分開，在脱色時就不能將第一步染上的結晶紫的顏色脱去，可能會使革蘭陰性菌也出現紫色，誤認為革蘭陽性菌。

2、脱色時間 陽性菌透性小，不易被脱色，陰性菌透性大，易脱色；但這是在固定的時間條件下的結果，如果延長脱色時間，也會使脱色劑滲透進陽性菌的細胞壁中，使染上的結晶紫脱去顏色，最後染上覆紅的顏色，變成革蘭陰性菌。而脱色時間太短的話又會使陰性菌染上的結晶紫不能完全脱色，出現紫色，誤認為革蘭陽性菌。

3、固定方法 固定不僅能殺死細菌，改變細菌對染料的通透性，還能使細菌吸附在玻片上，保持原有的形態結構。固定方法是將乾燥後的細菌塗片以中等速度通過火焰三次，以玻片觸及手背皮膚熱而不燙為宜。但在實際操作中有的同學將玻片在火焰上烤的太久，改變了細菌原有的通透性，會使細菌的染色性發生變化。影響了染色的結果。

1、細菌培養時間 細菌的典型形態、染色性是在對數生長期，取這時的細菌做革蘭染色可以反應細菌的真實的染色性。如果細菌培養時間太長，變成了老齡菌，染色性就會發生變化，可能會使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。

2、培養基的成分 一般認為革蘭陽性菌體內含有特殊的核蛋白質鎂鹽與多糖的複合物，它與碘和結晶紫的複合物結合很牢，不易脱色。但是如果培養基中缺乏核蛋白質鎂鹽就不能合成菌體成分的核蛋白質鎂鹽，細菌與碘和結晶紫的複合物結合就不牢固，容易脱色，可能會使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。

1、碘液 碘液作為媒染劑能增加染料與被染物的親和力。如果碘液放置時間太長，或經日光照射失效，失去媒染劑的作用，就可能使結晶紫與細菌結合的不牢固，容易被脱色，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。

2、結晶紫 結晶紫的濃度太高，就會使染上的顏色不容易被酒精脱色，可能會使革蘭陰性菌染成革蘭陽性菌。

3、酒精 酒精作為脱色劑，革蘭染色的脱色酒精濃度為95% ，在此濃度下革蘭陽性菌染上的結晶紫不易被脱去，保留紫色，革蘭陰性菌染上的結晶紫容易被脱去，最後呈紅色。但當酒精的濃度為70% 時，它的脱色能力最強，可能使革蘭陽性菌染上的結晶紫也被脱去，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。 ^[1]