鈣化作用

碳酸鈣在土體中淋溶、澱積的過程。在乾旱、半乾旱氣候條件下，土壤淋溶作用較弱，為季節性淋溶，易溶性鹽類大部分淋失，而硅鋁鐵等基本上不發生移動，而鈣則成為化學遷移中標誌元素。土壤表層殘存的鈣和植物體分解釋放的鈣，在雨季以重碳酸鈣的形態向下移動，隨着條件的改變，在剖面中下部以碳酸鈣的形式澱積，形成鈣積層。由於自然條件（主要是氣候條件）的差異，鈣積層出現的深度和厚度隨土類而異。鈣化作用是草原土壤形成過程的一個共同特點。

為了探討CO₂海底封存潛在的滲漏危險對於海洋生物的可能影響，以大型鈣化藻類小珊瑚(Corallinapilulifera)為研究對象，在室內控光控温條件下，通過向培養海水充入CO₂氣體得到3種不同酸化程度的培養條件(pH 8.1、6.8和5.5)，24h後比較藻體光合作用和鈣化作用情況。結果顯示：相對於自然海水培養條件(pH 8.1)，在pH 6.8條件下培養的小珊瑚藻光合固碳速率得到了增強，而在pH 5.5條件下光合固碳速率則降低；隨着酸化程度的增強，藻體的鈣化固碳速率越來越低，在pH 5.5條件下甚至表現為負值[(-2.53±0.57)mg C g^-1_乾重h^-1]；藻體顆粒無機碳(PIC)和顆粒有機碳(POC)含量的比值隨着酸化程度的加強而降低，這反映了酸化對光合和鈣化作用的綜合效應。快速光反應曲線的測定結果顯示：隨着酸化程度的增強，強光引起的光抑制程度越來越強；在酸化條件下，藻體的光飽和點顯著降低，但pH 6.8和5.5之間沒有顯著差異；低光下的電子傳遞速率在pH 8.1和6.8之間沒有顯著差異，pH 5.5培養條件下顯著降低；最大電子傳遞速率在pH 6.8時最大，在pH 5.5時最低。以上結果説明，高濃度CO₂引起的海水酸化顯著地影響着小珊瑚藻的光合和鈣化過程，不同的酸化程度下，藻體的光合、鈣化反應不同，在較強的酸化程度下(pH 5.5)，藻體的光合和鈣化過程都將受到強烈的抑制，這些結果為認識CO₂海底封存滲漏危險對海洋鈣化藻類的可能影響提供了理論參考。 ^[1] 

藍細菌鈣化作用，是一種主要通過光合作用吸收CO₂和HCO₃併產生鞘內的pH值變化來實現誘導碳酸鹽礦物沉澱的重要機制。藍細菌鈣化產物是那些謎一樣的化石，如葛萬菌、附枝菌、腎形菌。鈣化藍細菌化石的地史分佈表明，藍細菌鈣化作用與海水化學條件及大氣圈CO₂和O₂含量的長時間變化存在着成因聯繫，從而成為重要的生物沉積現象。多年的研究表明，當p（CO₂）分壓下降到10PAL（present atomosphere level）以下及p（O₂）分壓上升時，誘導了藍細菌鞘內二氧化碳濃縮機制（CCMs）的形成。CCMs促進的活體內鞘的鈣化作用，與大氣圈的CO₂濃度有着直接的生態生理學聯繫。在1.2Ga最早的活體內鈣化藍細菌鞘可能反映了CCMs相對早期的起源。追逐藍細菌鈣化作用，不但拓寬了沉積學的研究範疇，也為了解那些謎一樣的鈣化化石的生物親和性提供一些新的理念和思考途徑。 ^[2] 

工業革命以來，人類活動釋放的大量CO₂進入大氣層，不僅產生嚴重的温室效應，也使得全球海洋出現酸化的現象。造礁珊瑚被認為是受海水酸化影響最大的類羣。本研究以鹿角杯形珊瑚(Pocillopora damicornis)為研究對象，通過氣體交換法模擬未來的酸化環境(2100年)研究鹿角杯形珊瑚的鈣化率和光合能力(Fv/Fm)對酸化的響應。實驗設置兩個pH組(分別為7.8和8.1)，自然光下進行4周的實驗，水温控制在(27.5±1)℃。由於珊瑚等生物的代謝過程(主要是呼吸作用)，實驗系統的pH晝夜變化顯著，酸化處理組和對照組的pH分別介於7.69~7.91和7.99~8.29。鹿角杯形珊瑚的生長率介於1.15%~2.09%/周，酸化對鹿角杯形珊瑚的鈣化率和光合效率沒有顯著的影響，鹿角杯形珊瑚對酸化的敏感度低。對比歷史研究數據，本研究的結果進一步表明酸化對造礁珊瑚的影響存在種的特異性。推測鹿角杯形珊瑚對酸化的抗性可能與該珊瑚在有光的條件下能夠利用HCO₃^-以及能夠上調鈣化位點的pH有關。這種特異性的pH緩衝能力使得珊瑚能維持鈣化位點鈣質基質高的文石飽和度(Ωarag)，因此能以小的額外能耗提高造礁珊瑚的鈣化率。 ^[3] 

隨着我國風濕熱發病率下降及老齡化加劇，退行性鈣化性主動脈瓣膜病(DCAVD)成為老年人最常見的心臟瓣膜病。DCAVD已成為我國老年人心衰、暈厥甚至猝死的主要病因之一，尚無有效藥物能預防或延緩其進展，手術仍是最有效的治療手段 。至今，DCAVD發病機制仍不清楚，有待進一步研究。Mohler等已分離出瓣膜間質細胞(VICs)，並證實其在特定條件下可轉化為成骨細胞樣細胞，並形成鈣結節。研究證實主動脈鈣化瓣膜中成骨細胞和骨組織的標誌物表達升高，如鹼性磷酸酶、骨鈣蛋白、骨橋蛋白等。研究方法：

1、差異miRNAs篩選及目標miRNA確定：對瓣膜鈣化組織和相對正常組織提取RNA，通過miRNA芯片技術測定miRNA表達情況，篩選出差異miRNAs，從差異miRNAs中選取miRNA-449c-5p作為研究對象，通過RT-PCR技術驗證其差異表達。

2、VICs培養和鑑定：術中留取人正常主動脈瓣膜，採用改進的膠原酶消化法獲取VICs，並對VICs進行細胞表型鑑定。

3、差異性表達1niRNA-449c-5p的功能驗證：將miRNA-449c-5p mimics、inhibitor和negative control分別導入VICs，模擬過表達和低表達miRNA-449c-5p，進行轉染效率測定，然後進行成骨誘導，在7天和14天進行RT-PCR、Western blot、ALP活性測定及茜素紅染色，驗證miRNA-449c-5p對VICs成骨分化的影響。

4、miRNA-449c-5p調控VICs成骨分化的機制：通過miRNA專業靶基因預測網站，初步預測miRNA-449c-5p靶基因，再通過雙熒光素酶實驗，驗證兩者結構匹配程度，最後通過SiRNA技術驗證靶基因的真實性。

5、VICs成骨誘導中，IL-6對miRNA-449c-5p的調控作用：首先，收集VICs成骨誘導前和誘導後24h、48h的培養基，檢測其IL-6濃度；其次，VICs培養基中，加入IL-6對其刺激，分別於加入前和加入後24h、48h收集細胞，行miRNA-449c-5p測定。

6、動物實驗：將miRNA-449c-5p agomirs、antagomirs及negative control分別經尾靜脈注射入Balb/c小鼠體內，分別過表達和低表達miRNA-449c-5p，然後皮下注射Vitamin D3誘導軟組織鈣化，6周後行心臟超聲檢測。第二部分回顧性分析2010年5月至2014年7月我院收治的62例活動期IE患者血培養結果及臨牀資料，所有患者均早期外科治療，術後長期隨訪。

研究結果：1、成功篩選出DCAVD相關的差異miRNAs，並從中選取miRNA-449c-5p作為研究對象；

2、成功分離出VICs，並對其表型進行了鑑定，證實其達到體外實驗要求；

3、對miRNA-449c-5p進行功能研究，動物水平、細胞水平、蛋白水平和mRNA水平研究顯示，miRNA-449c-5p能夠調控VICs成骨分化；

4、通過靶基因專業預測網站，預測miRNA-449c-5p靶基因為Smad4，通過雙熒光素酶報告實驗，確定Smad4為其靶基因，最終確定miRNA-449c-5p通過TGF-β/Smad通路調控VICs成骨分化；

5、證實VICs成骨分化中，分泌型IL-6表達上調，而IL-6刺激VICs可導致其miRNA-449c-5p表達下調，從而證實DCAVD發病中IL-6可能調控miRNA-449c-5p的表達；6、活動期IE主要病原菌為鏈球菌、糞腸球菌和金葡菌，圍術期死亡2例，餘60例治癒出院，57例術後長期隨訪心功能Ⅰ級42例，Ⅱ級15例，隨訪期均無IE復發。

結論：1、篩選出DCAVD特異性miRNA表達譜；

2、miRNA-449c-5p靶基因為Smad4，通過TGF-β/Smad信號通路在體內外水平調控VICs成骨分化；

3、IE病原菌以革蘭氏陽性菌為主，需根據藥敏結果合理選擇抗生素，早期手術治療活動期IE臨牀療效滿意。 ^[4] 

脂聯素對平滑肌細胞體外鈣化的作用研究

第大鼠血管平滑肌細胞體外鈣化特性的觀察目的：血管鈣化是一種類似於骨基質礦化的過程。鈣化的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)可合成並分泌多種骨特異性蛋白。本研究通過β-甘油磷酸誘導大鼠VSMCs體外鈣化，觀察鈣化的VSMCs中鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性，Ⅰ型膠原和骨鈣素(osteocalcin，OC)含量的變化。

方法：應用免疫細胞化學方法鑑定VSMCs。β-甘油磷酸促進VSMCs體外鈣化，採用α-磷酸奈酚法測定ALP活性，ELISA法測定Ⅰ型膠原含量，放射免疫法測定OC含量。

結果：(1)平滑肌α-肌動蛋白的免疫細胞化學染色證實培養的細胞是VSMCs。(2)β-甘油磷酸促進VSMCs體外鈣化的過程中，ALP活性明顯提高，Ⅰ型膠原和OC分泌顯著增加。結論：鈣化的大鼠VSMCs ALP活性提高，Ⅰ型膠原和OC分泌增加，具備成骨細胞表型特徵。 ^[5] 

顆石藻是海洋浮游植物功能羣中一類重要的鈣化生物類羣，同時也是海洋中生源無機碳的主要來源，其通過光合作用(有機碳泵)和鈣化作用(碳酸鹽反向泵)兩個過程，將海水中的溶解無機碳(DIC)轉化為顆粒有機碳(POC)和顆粒無機碳(PIC)。

基於2009年冬季(2月11日至21日)在南海北部進行的斷面調查，以及2009年夏季(7月18日至8月31日)在南海、黃東海進行的大面調查。研究內容主要包括：海水葉綠素a含量；浮游植物丰度和碳生物量；顆石藻丰度、碳生物量和顆石粒方解石(CaCO₃)含量；顆粒碳庫(Phyto-C、POC、PIC)；鈣化速率(pPIC)和固碳速率(pPOC)；温度、鹽度、營養鹽等參數。海水葉綠素a含量使用熒光法進行測定；浮游植物丰度和碳生物量採用Uterm?hl倒置顯微鏡和細胞體積轉化法；顆石藻丰度和碳生物量採用偏光顯微鏡方法；顆石粒方解石含量採用掃描電子顯微鏡顆石粒體積轉化法。 ^[6] 

呼吸熵(RQ)是動物生理及能量代謝的常用指標之一.在計算呼吸熵時，釋放CO₂的量通常被直接應用.在具有鈣化作用的海洋生物中，鈣化會影響試驗水體溶解無機碳(DIC)含量，如果被忽略可能會產生方法上的誤差.本文通過呼吸瓶法對養殖長牡蠣及其3種附着生物(紫貽貝、玻璃海鞘和柄海鞘)呼吸熵與氧氮比(O/N)的測定，探討水產動物呼吸熵測定中鈣化作用的影響.結果表明：長牡蠣與紫貽貝的鈣化率分別為(56.37±14.85)和(17.95±7.21)μmol·g^-1·h^-1，並因此減少水體DIC(3.72±0.80)和(1.48±0.14)mg·L^-1，分別佔到呼吸增加DIC的(60.9±7.6)%和(39.9±5.7)%。4種試驗生物的呼吸熵分別為：長牡蠣1.38±0.19、紫貽貝1.18±0.11、玻璃海鞘1.11±0.05、柄海鞘1.32±0.19。除玻璃海鞘外，均與O/N的結果相符，而其中具有鈣化作用的長牡蠣和紫貽貝校正前的呼吸熵僅為0.56±0.19和0.70±0.04，不符合O/N的測定值，表明生物鈣化對水體中的DIC有明顯地吸收固定作用，在呼吸熵的測定中應被準確計算在內。 ^[7] 

在體外血管鈣化模型基礎上探討同型半胱氨酸 (HCY)對血管鈣化的影響。

建立牛主動脈平滑肌細胞體外鈣化模型 (鈣化BASMCs) ，檢測HCY對細胞層鈣含量、培養上清骨鈣素濃度及鹼性磷酸酶活性的影響 ，並檢測骨鈣素、骨橋蛋白及Ⅰ型膠原 (ColⅠ )mRNA表達的變化及抗氧化劑N 乙酰半胱氨酸對HCY促鈣化作用的影響。

HCY劑量依賴性促鈣化BASMCs鈣沉積 ，但不促進非鈣化的BASMCs鈣沉積 ；N 乙酰半胱氨酸抑制HCY對鈣化BASMCs鈣沉積的促進作用 ，但在鈣化BASMCs中單純加入等劑量的N乙酰半胱氨酸對鈣沉積無影響；HCY促鈣化BASMCs培養上清骨鈣素含量增加，且使骨橋蛋白、骨鈣素、ColⅠmRNA表達分別增加 56.33 %、86.48%及 110.64%，但對正常培養的BASMCs培養上清骨鈣素含量及骨橋蛋白、骨鈣素mRNA表達無影響，僅使ColⅠmRNA表達增加 108.33 %；HCY不影響正常及鈣化BASMCs鹼性磷酸酶活性。

（1）HCY是鈣化的促進因子，而非啓動因子 ；

（2）HCY的促鈣化作用可能部分是通過細胞外基質途徑實現的；

（3）N 乙酰半胱氨酸阻斷HCY的促鈣化作用，間接提示氧化反應參與此過程；

（4）HCY的促鈣化作用與鹼性磷酸酶活性無關。 ^[8]