遊離棉酚

英國化學家Longmore在1886年從棉籽中分離出來棉酚，俄國人Marchlewski在1899年從棉籽油的廢渣中分離出純的棉酚，它是一種黃色色素物質，被用來做為染料，但是發現這個色素很不穩定，特別是在光照條件下不穩定。1906年，科學家Cook研究發現了棉酚對棉花病蟲害防治的重要性。1915年，Withers研究發現了棉籽粕中棉酚具有毒性，之後又發現了棉籽粕中的棉酚對動物也具有毒性。1927年，Clark對棉酚的分子結構進行研究，得到分子式為C₃₀H₃₀O₈。1938年，Adams確定了棉酚的結構，指出棉酚能發生很多化學反應。1958年，Edwards對棉酚進行合成，再次驗證棉酚的結構。20世紀60年代開始，外國學者對棉酚的旋光異構體進行研究，左旋棉酚的毒性和藥理活性均高於右旋棉酚。60年代初，科學家研究發現棉酚具有抗腫瘤的作用。1978年，我國學者研究表明棉酚能被用來作男性節育藥，但副作用是低血鉀症和不可逆不育。後來棉酚被應用於治療女性子宮內膜異位症、痛經和子宮肌瘤等，是棉酚研究上的又一個進展。此外棉酚還具有抗病毒和免疫作用，具有很大的應用前景和經濟價值。20世紀以來，棉酚的研究內容主要包括棉酚的毒性及脱毒方法、理化性質、棉酚的提取與合成、棉酚的抗生育等藥理活性和棉酚旋光異構體的拆分等。

棉酚是錦葵科棉屬植物色素腺產生的多酚二萘衍生物。棉酚及類棉酚色素集中在棉籽仁的球狀色腺體中，色腺體周圍為棉籽仁的肉質，其在棉籽中的含量約為0.7%~4.8%，其中在棉籽殼中含量約為0.005%~0.01%，在棉仁中含量約為0.5%~2.5%，棉仁中存在着佔仁重約為1.5%~2.7%的棉酚腺體，其色澤由淡黃色至櫻桃紅，是棉籽中含棉酚最密集的部分，棉酚佔腺體重量的35%~50%左右。色腺體中還存在其它類棉酚色素，如棉酚嘌呤約佔0.05%~13%。棉仁中棉酚的存在形式有兩種，即遊離棉酚和結合棉酚，兩者之和稱為總棉酚。遊離棉酚是指在棉仁組織中呈遊離狀態存在的棉酚；而結合棉酚是棉酚與其他物質（主要是蛋白質）結合的產物。只有遊離棉酚對人畜具有毒性。

棉酚是一種從棉籽中分離出來的黃色的色素物質，是倍半萜多酚型物質——多酚輕基聯萘化合物，其分子式為C₅₀H₅₀O₈，分子量為518.54。具有半縮醛型、烴基醛型和烯醇型三種互變異構體。由於棉酚具有醛基、羥基等官能團，故化學性質較活潑。棉酚易溶於有機溶劑，如丙酮、乙醇、乙醚、甲醇、乙腈、氯仿等，可用於棉酚的提取，難溶於己烷和高沸點的石油醚，不溶於水和低沸點的石油醚。棉酚易被氧化劑氧化而變質，導致顏色逐漸加深，且容易和醋酸反應生成醋酸棉酚，和甲酸反應生成甲酸棉酚，和苯胺反應生成穩定的非離子化合物，而這些物質在加熱的作用下會重新分解，可以用來精製和提純棉酚。棉酚具有酸性，能夠與鹼反應生成棉酚鹽而溶於水，利於棉酚與油分離。

遊離棉酚是具有活性醛基和活性羥基的棉酚，其毒性較大，在生物體內與酶和蛋白質結合，破壞蛋白質的可消化性，使胃黏膜組織易受破壞並引起消化功能紊亂，含量超過安全界限，將導致生長遲緩、中毒及死亡。此外，由於棉酚能與蛋白質中賴氨酸的 ε－氨基酸結合，賴氨酸的有效成分被大大降低了，其營養價值也被減低了。

遊離棉酚毒性主要由活性醛基和活性羥基產生毒性而引起多種危害，大量棉酚進入消化道後可刺激胃腸粘膜引起胃腸炎，並能增加血管壁的通透性，使血漿、血細胞滲到外周組織，使受害組織發生血漿性浸潤。進入血液後能損害心、肝、腎等質性器官，另外在體內能與蛋白質和鐵等結合，使體內一些功能蛋白酶失活，與鐵結合則易導致缺鐵性貧血。此外還能影響雄性動物的生殖機能造成性不育；影響蛋品質，使其蛋黃變為綠色或紅褐色。 ^[1] 

遊離棉酚的檢測研究大多集中在對棉籽仁、棉粕及棉籽油的檢測，對生物樣品的檢測報道較少，分光光度法和高效液相色譜法(HPLC)是遊離棉酚檢測的兩種常用方法。其中分光光度法中又有AOCS法、國標法、Smith法，HPLC法具有更高的準確性。此外還有薄層色譜法(TLC)，高效毛細管電泳法，高效液相色譜—質譜聯用法及高效液相色譜串聯質譜法，後兩者則主要應用於遊離棉酚含量較低的生物樣品的測定。我國現行飼料衞生標準對飼料中游離棉酚的允許量規定為≤1200mg/Kg。GB5009.148-2011規定，棉籽油中游離棉酚含量不超200mg/Kg。 ^[2] 

分光光度法中的國標方法適用於測定棉籽油。原理是將70%的丙酮作為提取溶劑，遊離棉酚在378nm處有最大吸收，測定不同濃度棉酚標準品的吸光值並繪製出標準曲線，同時測定樣品的吸光值並與標準曲線比較而定量。雖然這種方法操作簡便，但是準確性較差。苯胺法是1962年由Smith首創的棉酚測定經典方法，該方法的特點在於快速、準確並且成本低，被作為我國飼料中游離棉酚測定的現行國家標準 ^[3]  ，主要適用於棉籽餅、棉籽粕和含這些物質的配合飼料中游離棉酚含量的測定。該方法的基本原理採用異丙醇與正己烷的混合溶劑對遊離棉酚進行提取，並與苯胺反應將棉酚轉化為苯胺棉酚，於最大吸收波長440nm處測定吸光值。AOCS（美國油脂化學協會）法結合了以上兩種紫外方法，用國標法的提取溶劑，加入苯胺，在445nm波長下測定遊離棉酚的吸光值。賀秀媛 ^[4]  等在飼料中游離棉酚測定的國家標準基礎上，對該方法進行改進，將振盪提取改為自然浸提，操作更加簡便，與國標法相比遊離棉酚含量測定結果無顯著性差異。

高效液相色譜法是比較靈敏且準確的遊離棉酚測定方法。我國出台了植物性食品中游離棉酚檢測的高效液相色譜法 ^[2]  ，該方法適用於植物油或以棉籽餅為原料的其他食品，以無水乙醇為溶劑振搖提取，流動相為甲醇:2%磷酸=85:15，檢測波長235nm。在動物體內遊離棉酚檢測方面，崔曉明 ^[5]  等建立高效液相色譜法檢測肉樣中游離棉酚含量，用70%的丙酮溶液提取遊離棉酚，流動相乙腈:0.2%甲酸=85:15，檢測波長235nm，結果遊離棉酚的保留時間為7.8min，回收率、精密度及RSD符合殘留分析要求，對市場上的肉樣進行檢測，未檢出遊離棉酚。棉酚旋光異構體含量測定的關鍵在於遊離棉酚的拆旋，原理是將棉酚的醛基與手性氨基化合物進行縮合，其產物的理化性質，尤其是色譜行為差異較大，再用高效液相色譜儀進行分離和檢測。2007年，農業部出台了棉籽中棉酚旋光異構體測定的HPLC法 ^[6]  ，該法所採用的拆分試劑為L-苯基丙氨醇，與遊離棉酚發生衍生化反應，分別生成(-)-棉酚-L-苯基丙氨醇和(+)-棉酚-L-苯基丙氨醇，以甲醇:水:磷酸=85：15：0.1為流動相，在C₁₈柱上兩者有不同的保留時間，從而達到分離，檢測波長為254nm，左旋棉酚衍生物保留時間在4min左右，右旋棉酚衍生物保留時間在6min左右。吳大方69等採用高效液相色譜法檢測人血漿中左旋棉酚和右旋棉酚含量，該法採用2-氨基1-丁醇為拆分試劑，甲醇:異丙醇:水:磷酸=80：20：20：0.1為流動相，波長254nm，右旋棉酚衍生物與左旋棉酚衍生物的保留時間分別為4min和8min。林立行等]採用HPLC電化學檢測器測定大鼠血液、睾網液及附睾液中左旋棉酚和右旋棉酚含量，通過靜脈注射左旋棉酚或右旋棉酚於大鼠體內，使棉酚蓄積，樣品用乙腈沉澱蛋白，氯仿提取棉酚，流動相為甲醇：0.1mol/m L磷酸鹽緩衝液=90：10，電壓0.7V，結果線性範圍為1～6μg，回收率及RSD均符合生物樣品測定要求。何曉文等2012年以(R)-(-)-2-Amino-1-propanol為拆分試劑，對棉籽中游離棉酚進行衍生化，測定其中左旋棉酚和右旋棉酚含量，HPLC色譜條件為乙腈：10m MKH₂PO₄（磷酸調p H3.0）=80：20，流速為1.0m L/min，檢測波長為247nm，右旋棉酚衍生物保留時間5.5min，左旋棉酚衍生物保留時間8.8min。

薄層掃描法是以丙酮或乙醇溶液提取樣品，經過濾後用薄層掃描儀掃描棉酚色斑光密度積分值，再與標準色斑進行比較，即可得出樣品中游離棉酚含量。根據Rf值可對待測物質作定性鑑定，根據斑點面積或顏色深淺可作定量分析。沈靜 ^[7]  等用高效薄層色譜法測定棉籽油中游離棉酚含量，採用0.5%CMC-Na硅膠G高效薄層板，展開劑為甲苯：甲酸乙酯:甲酸:丁酮=50:8:1.5:1，顯色劑為飽和三氯化銻氯仿溶液，雙波長紫外反射法掃描，檢測波長550nm，參比波長750nm，結果棉酚對照品溶液點樣量與峯面積在線性範圍0.08～1.28μg內呈良好線性關係，平均回收率為91.5%～100.2%。

高效毛細管電泳法(HPCE)相比高效液相色譜法成本低，但重複性差，研究報道少。姚軍 ^[8]  等採用HPCE法測定新疆南疆地區棉籽仁中游離棉酚含量，毛細管柱長度78.5cm、內徑75μm，分離電壓為20kv，進樣量為0.5psi×10sec，温度為25℃，緩衝鹽為0.01%mmol/L的四硼酸鈉-磷酸(p H=8.0)，檢測波長235nm，結果棉酚在5.0～50.0μg/m L範圍內呈良好線性關係，回收率97.5～98.4%，遊離棉酚在棉籽中含量為0.60～1.04%。Sergey Vshivkova等採用毛細管電泳法檢測棉花花瓣和種子中的棉酚對映體，採用有效長度24.5、內徑50μm的毛細管柱，分離電壓15kv，温度15℃，硼酸緩衝液(p H=9.3)，結果表明該方法準確度高，檢測限為36ng/m L，在6min內棉酚對映體達到分離。

高效液相色譜質譜聯用法(HPLC-MS)及高效液相色譜串聯質譜法(HPLC-MS/MS)比較適用於生物樣品中較低濃度的遊離棉酚及其代謝產物的檢測，靈敏度好，專屬性高。卞小潔 ^[9]  等建立了檢測人血漿中棉酚的HPLC-MS法，血漿樣品中游離棉酚用乙醚進行提取，流動相為乙腈：30mmol/L醋酸銨（含1%甲酸和0.3%四氫呋喃）=85:15，負離子模式，選擇性離子監測，棉酚的檢測離子為517.2，內標物甘草次酸的檢測離子為469.3，氮氣流速7L/min，霧化室壓力40psig，氮氣温度350℃，毛細管電壓4000V，結果棉酚的保留時間3.6min，甘草次酸的保留時間3.1min，準確度和精密度符合要求，可用來測定生物樣品中游離棉酚含量。施琦貽採用高效液相色譜串聯質譜法測定鮮蛋黃中游離棉酚的含量。用丙酮提取蛋黃樣品中的遊離棉酚，C18色譜柱進行色譜分離，以甲醇:1%甲酸=90:10為流動相，採用多反應監測模式，棉酚的定性離子對為517.4/259.3，定量離子對為517.4/231.3。遊離棉酚含量在1～100ng/m L範圍內線性關係良好，定量限為1ng/m L，平均回收率和RSD均符合測定要求。

棉酚的製備可以從棉仁粉、棉籽餅粕和棉籽油、皂腳中得到，先將遊離棉酚轉化為苯胺棉酚、醋酸棉酚，然後經水解精製得到純棉酚。

棉酚的製取，普遍採用了溶劑提取一苯胺沉澱法。利用棉酚在極性溶劑中溶解度大，將棉仁直接浸泡在溶劑中，在浸出液中加入苯胺使遊離棉酚與苯胺定量生成苯胺棉酚沉澱全部析出，將其沉澱過濾，再進一步後處理和精製醋酸棉酚粗品。因此，作為一種中間產物，苯胺棉酚的生成量多少將直接影響着醋酸棉酚的含量，常見的浸取溶劑有丙酮、異丙醇、乙醇等。獲得中間產物苯胺棉酚之後，在酸性環境下，苯胺棉酚可轉化為醋酸棉酚，最後水解精製、濃縮結晶獲得純棉酚。

棉酚最重要的應用是在醫藥方面，早在70年代我國醫學工作者已經發現了棉酚的抗生育作用，經精製的醋酸棉酚用作男性節育藥，明顯降低了精子的成活率，證實棉酚是一種效果可靠的男性節育藥。但是用苯胺法生產的棉酚在臨牀實驗中，發現有0.99%的實驗者患低血鉀肌無力症。一般認為是苯胺棉酚在轉化為醋酸棉酚時可能因轉化不完全而使部分單苯胺棉酚，甚至是二苯胺棉酚殘留在醋酸棉酚中，引起了低血鉀症。出現了一種新的途徑來利用棉酚進行抗生育實驗,即將低劑量棉酚(一般有效劑量的0.2%)與多聚乳糖酸連接，製備成藥物緩釋系統，直接注入輸精管進行高效殺精。這種方法持續、直接、有效且無副作用，保持了棉酚的強抗受精作用，同時降低了其毒副作用。 ^[10] 

棉酚除了可作為男性抗生育用藥外，也可適用於治療女性某些激素依賴性疾病，如子宮內膜異位症、子宮肌瘤、功血和痛經等。棉酚具有抗瘧疾的作用，可殺死皰疹等病毒。此外,棉酚還對胃癌、肺癌、肝癌、結腸癌等有一定的療效。

棉酚及其某些衍生物具有抗氧化劑的性質，因此，可用作氧化抑制劑。棉酚在橡膠工業、聚乙烯工業、聚丙烯工業以及作為火箭燃料中的抗氧化劑方面的應用已有相關報道。雖然棉酚有很高的抗氧化能力，但是因為本身的微弱毒性，限制了棉酚在食品行業中的應用，一般僅做為化工產品的抗氧化劑。另外，棉酚還可以做為石油、機械加工、築路方面的穩定劑。