全譜氨基酸

全譜氨基酸除了包含必需氨基酸外，也包含各種非必須氨基酸。基本由以下幾種組成：

精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸（蛋氨酸）、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、γ-氨基丁酸、甘氨酸、絲氨酸、牛磺酸、酪氨酸、a-氨基已二酸、天門冬酰胺、天門冬氨酸、瓜氨酸、穀氨酸、谷氨醯胺、鳥氨酸、半胱氨酸、胱硫醚 、同型半胱氨酸、α-氨基正丁酸 、丙氨酸、鵝肌肽 、b-丙氨酸、b-氨基異丁酸、肌肽、乙醇胺、δ-羥基賴氨酸 、羥化脯氨酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸、磷酸乙醇胺、磷酸絲氨酸、脯氨酸、肌氨酸、精氨(基)琥珀酸、羥化瓜氨酸。

全譜氨基酸在體內是一個平衡狀態，這一狀態的失衡是眾多疾病的誘因或表現形式。全譜氨基酸檢測可以作為健康診斷和疾病篩查的重要手段，可以為及早預防疾病、改善身體營養狀態和營養補充提供參考標準 ^[1]  。全譜氨基酸失衡是眾多疾病的誘因或表現形式，涉及代謝、腫瘤、免疫、病毒、心腦血管、神經系統、腎病、糖尿病、亞健康、老年病等各類疾病和兒童生長髮育、營養健康、肌肉骨骼生長、激素分泌、解毒功能等人體各種健康環節。

全譜氨基酸檢測通過對人體內 42 種氨基酸的精確檢測，揭示人體內詳細的氨基酸代謝狀況，從而從不同的代謝路徑提示人體的健康狀況。不管是神經內分泌系統、氨能量代謝系統或者是硫代謝等等，各種代謝途徑都可以檢測到。氨基酸的研究是代謝組學中最為重要的一環。目前，科學對氨基酸的研究比較廣泛和系統，且現今氨基酸檢測技術繁多。1958年，Spackman等首先提出了用陽離子交換色譜與柱後茚三酮衍生結合的方法分析蛋白質中的氨基酸，實現了氨基酸分析的自動化 ^[2]  。其後，新的氨基酸分析方法不斷湧現，柱前衍生反相高效液相色譜法、高效陰離子交換色譜 - 積分脈衝安培檢測法、毛細管電泳法、串聯質譜法等相繼應用於氨基酸分析 ^[3]  。

大多數氨基酸不具備生色團，因此無法利用分光光度法直接檢測，故需採用化學衍生技術，使之生成可在紫外或可見光區有光吸收的化合物，或者採用熒光法檢測，但是衍生會導致反應產物多樣性。因此，經過衍生再進行分析，很難判斷降解物的來源，所以在氨基酸的分析中，如採用不經衍生就能直接檢測的技術，可避免定量衍生中一級氨和二級氨衍生化產物不同以及衍生化產物不穩定等帶來的問題。高效陰離子交換色譜-積分脈衝安培檢測技術與蒸發光散射檢測技術是目前常用的兩種氨基酸直接檢測技術，其中蒸發光散射檢測技術已經在藥物分析、生化物質測定、高分子分析、表面活性劑等方面得到廣泛應用。蒸發光散射檢測技術與HPLC聯用測定氨基酸，具有如下特點：靈敏度高，可消除溶劑等的影響；對流動相系統温度變化不敏感，可進行梯度洗脱；可擴大液相色譜的應用範圍，能消除雜質和流動相的紫外吸收干擾；無需測定校正因子就可進行定量分析；分析氨基酸無需柱前、柱後衍生，可一次進樣進行測定。

（1）柱後衍生高效陽離子交換色譜分析法

高效陽離子交換色譜（HPCEC）-柱後茚三酮衍生光度檢測分離測定氨基酸是一種經典的氨基酸分析方法。該方法利用氨基酸在酸性條件下形成陽離子而在陽離子交換柱中分離，分離後的氨基酸用茚三酮衍生而在紫外可見光檢測器下可被檢測到。該方法以陽離子交換樹脂為固定相、酸性緩衝液為流動相，在柱後流出液中加入茚三酮使氨基酸生成具有可見光吸收的衍生物來進行檢測，具有重現性好、儀器穩定、結果可靠、適合於大量常規樣品分析等優點。另外，由於衍生化反應發生在氨基酸與其物質分離之後，因而避免了其他物質的干擾，適合複雜樣品中氨基酸的分析。但是此方法儀器複雜、體積大、費用高，且脯氨酸與其它氨基酸檢測波長不同不能同時測定。氨基酸分析自動儀就是基於陽離子交換色譜分離、柱後茚三酮衍生光度檢測技術設計的。目前的自動氨基酸分析儀可將分析時間縮短至1h以內。氨基酸自動分析儀實際上屬專門用來分析氨基酸的高效液相色譜儀，其優點是高壓、快速、靈敏，試劑和樣品用量少、重現性好、分析結果穩定，因而被廣泛用於食品、醫學、農業以及微生物等領域。

（2）柱前衍生反相高效液相色譜分析技術

柱前衍生反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分析氨基酸近年來得到了迅速發展，逐漸取代柱後衍生高效陽離子交換色譜（HPCEC）在許多領域中的應用。RP-HPLC 分析方法更加快速靈敏，與專業氨基酸分析的自動分析儀不同，其適用性更廣、更靈活。RP-HPLC 要求將氨基酸在柱前轉化為適於反相色譜分離並能被靈敏檢測的衍生物，柱前衍生的關鍵在於衍生試劑的選擇。選擇衍生試劑的標準是能與各氨基酸定量反應，每種氨基酸只生成一種化合物且產物有一定的穩定性，不產生干擾物或產生易於排除的干擾物。該法操作簡單，色譜分離分辨率高、檢測靈敏度高，分析時間短，便於實現自動化和使產物能在不同型號的高效液相色譜儀上測定。目前常用的柱前衍生試劑有鄰苯二甲醛（OPA）、異硫氰酸苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）及丹酰氯（Dansyl-Cl）。衍生後的氨基酸一般鍵合在 C18 柱上，利用液液分配原理進行分離。流動相多以乙酸鹽或磷酸鹽緩衝液為主，以乙腈、甲醇或四氫氟喃為調節劑。由於氨基酸衍生物仍保留着兩性化合物的特點，除改變調節劑之外，還可通過調節緩衝液 pH 值、離子強度、柱温等使之達到理想的分離。當然，不同衍生物所選用的柱型、流動相以及氨基酸的洗脱時間和順序不盡相同。柱前衍生反相高效液相色譜法可用於分析蛋白質水解液、生理體液和食品等多種樣品中的氨基酸。

（3）iTRAQ 試劑衍生、同位素內標標記、液相色譜-串聯質譜檢測氨基酸技術

質譜儀是用來測量單個分子質量的儀器，但實際上質譜儀提供的是分子的質量與電荷比（m/z 或m/e）。質譜法是一強有力的分析技術，它可用於未知化合物的鑑定、定量分析、分子結構及化學特性的確定等方面。iTRAQ 試劑為可與氨基酸 N 端及賴氨酸側鏈連接的胺標記同重（iso-baric）。在質譜圖中，任何一種 iTRAQ 試劑標記的不同樣本中的同一氨基酸表現為相同的質荷比。在串聯質譜中，信號離子表現為不同質荷比（114~117）的峯，因此，根據波峯的高度及面積，可以得到氨基酸的定量信息。iTRAQ試劑是一種小分子同重元素化學物質，包括三部分：一端是報告部分（reporter group），另一端是肽反應部分（peptide reactive group），中間部分是平衡部分（balance group）。iTRAQ 技術是由美國應用生物系統公司（Applied Biosystems Incorporation，ABI）2004年開發的同位素標記相對和絕對定量（isobaric tagsfor relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術，是一種新的、功能強大的可同時對四種樣品進行絕對和相對定量研究的方法，這種方法是建立在 iTRAQ 試劑的基礎上。iTRAQ 技術主要有分離能力強、分析範圍廣、定性分析結果可靠，可以同時給出每一個組分的分子量和豐富的結構信息等特點；MS 具備高靈敏度、檢測限低、分析時間快、分離效果好、自動化程度高等特點。運用 iTRAQ 試劑標記氨基酸，可以將氨基酸碎片離子從低分辨率的背景中脱離出來，提高檢測的靈敏度。串聯質譜 MRM 技術是目前用於定量的最好的質譜技術。此技術根據氨基酸母離子質量數與碎片離子質量數，選擇母粒子 - 子離子對，允許符合要求的子離子進入碰撞室，碰撞結束後，只記錄設定子離子信號，通過母粒子與子離子的兩次選擇，去除干擾離子，降低化學背景，提高靈敏度。在分析化學領域，這種質譜掃描模式已成熟運用於複雜體系的小分子化合物分析。iTRAQ 試劑衍生、同位素內標標記、LC-MS/MS技術檢測氨基酸可以達到 15 分鐘檢測 45 種氨基酸，相對於現行的其他設備 , 極大提高工作效率，減少了因檢測週期長而造成檢測時樣本內個別氨基酸相互轉化的影響，尤其是生物樣本。而且每一個氨基酸都有自己獨立的同位素內標，可以精確定量測定，嚴格區分測定同分異構體，高靈敏度，精確到 pmol 級別，線性範圍寬不受柱效降低而影響檢測結果。

此方法能夠同時分析複雜基質中 42 種氨基酸，為臨牀、科研、保健品藥品開發等提供了更多的信息。檢測的氨基酸涉及尿素循環、鳥氨酸循環、神經內分泌代謝、氨能量代謝、硫代謝、運動代謝組學等等多個代謝組學系統，為氨基酸代謝組學分析研究提供更多理論指導和技術支持 ^[4]  。