伊紅美藍

一種用於細胞染色的染料，又稱瑞氏染料，是鹼性染料美藍（Methvlem blue）和酸性染料黃色伊紅（Eostm Y）的合稱。伊紅美藍染料染色稱為瑞氏（Wright's staim；美藍－伊紅Y）染色。

用甲醇作瑞氏染料溶劑，即成瑞氏染液，或稱伊紅美藍染液。

伊紅鈉鹽的有色部分為陰離子，無色部分為陽離子，其有色部分為酸性，故稱伊紅為酸性染料。美藍通常為氯鹽是鹼性的，美藍的中間產物結晶為三氯化鎂複鹽，其有色部分為陽離子，無色部分為陰離子，恰與伊紅鈉鹽相反。

甲醇是瑞氏染料良好溶劑，有兩種作用：

1. 甲醇使瑞氏染料中美藍（M）與伊紅（E）在溶液中離解，可使細胞成分選擇性吸附其中的有色物質而着色。

甲 醇

ME（瑞氏染料）----→M+ + E-

在配製的瑞氏染液中美藍如放置過久即可氧化而含有天青，美藍天青與伊紅化合物能使核染成紫紅色，但不能使胞漿染為藍色，多餘美藍就可以使胞漿染成藍色，染色主要是化學作用，是離子彼此結合的反應。

2. 甲醇具有強大的脱水力，可將細胞固定在一定形態及增加細胞結構的表面積，提高細胞對染料吸收作用，同時由於甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反應。

瑞氏染料 830mg或1g

甲醇（AR） 500ml或600ml

○先稱乾燥（事先放入温箱乾燥過夜）瑞氏染料放置乳缽內，用乳棒輕輕敲碎染料成粉末，再行研磨至聽不到研芝麻聲即呈細粉末，加少許甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸內顯“一面鏡”光澤，而無染料粉粒沉着。

○再加較多量甲醇研磨呈一面鏡光亮，靜置片刻，將上層液體倒入一清潔儲存瓶內（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重複數次，至乳缽內染料及甲醇用完為止，搖勻，密封瓶口。

○存室温暗處，儲存愈久，則染料溶解、分解就越好，一般儲存3個月以上為佳。

●緩衝液作用：

○染色對氫離子濃度是十分敏感的，據觀察pH值的改變，可使蛋白質與染料形成的化合物重新離解。

○緩衝液須保持一定的pH使染色穩定，PBS的pH 一般在***~6.8，

○偏鹼性染料可與緩衝液中酸基起中和作用，偏酸性染料則與緩衝液中的鹼基起中和作用，使pH恆定。

●緩衝液配製（pH6.4~6.8，弱酸性）：

配方1 ：1% KH2PO4 30ml M/15 KH2PO4 73.5 ml

配方2 ：1% Na2HPO4 20ml M/15 Na2HPO4 26.5ml

H2O(新鮮) 加至1000ml

置室温黑暗處，瓶口密封，防止黴菌污染，如有污染則應報廢。

伊紅美藍培養基（eosin-methylene blue medium,簡稱EMB medium），一般用於檢測大腸桿菌。

伊紅為酸性染料，美藍為鹼性染料。當大腸桿菌分解乳糖產酸時細菌帶正電荷被染成紅色，再與美藍結合形成紫黑色菌落，並帶有綠色金屬光澤。而產氣桿菌則形成呈棕色的大菌落。

在鹼性環境中不分解乳糖產酸的細菌不着色，伊紅和美藍不能結合，故沙門氏菌等為無色或琥珀色半透明菌落。金葡菌在此培養基上不生長。

常用的伊紅美藍乳糖培養基，可用來鑑別飲用水和乳製品中是否存在大腸桿菌等細菌。如果有大腸桿菌，因其強烈分解乳糖而產生大量的混合酸，菌體帶H+，故菌落被染成深紫色，從菌落表面的反射光中還可以看到金屬光澤。

用伊紅美藍培養基鑑定水中大腸桿菌

步驟如下：

①製作伊紅美藍培養基，趁熱注入培養皿中，凝成平板，待用。

②用滅過菌的錐形瓶盛取河水或溝水，按1：10稀釋。

③取0.1毫升稀釋液接種於伊紅美藍培養基上。用平板劃線分離法進行分離。

④將劃線後的培養皿倒置37℃温箱中培養18～24小時。培養基中會出現大腸桿菌菌落，菌落中心呈暗藍黑色，發金屬光澤。

⑤將菌落接種於斜面培養基上（由營養瓊脂培養基製成）。

蛋白腖 10g

乳糖 10g

磷酸氫二鉀 2g

瓊脂 20~30g

蒸餾水 1000ml

2%伊紅水溶液 20ml

0.5 %美藍水溶液 13ml

先將瓊脂加至900ml蒸餾水，加熱溶解，然後加入磷酸氫二鉀及蛋白腖，混勻使之溶解，再以蒸餾水補足至1000ml，調整PH為7.2~7.4。趁熱用脱脂棉或絨布過濾，再加入乳糖，混勻後定量分裝於燒瓶內，置高壓蒸汽滅菌器內以115℃滅菌20min，貯存於冷暗處備用。

將蛋白腖、磷酸鹽和瓊脂溶解於蒸餾水中，校正PH，分裝於燒瓶內，121℃高壓滅菌15min備用。臨用時加入乳糖並加熱溶化瓊脂，冷至50～55℃，加入伊紅和美藍溶液，搖勻，傾注平板。