反饋

RNA-seq

RNA-seq（RNA sequencing^[1] ）即轉錄組測序技術，就是用高通量測序技術進行測序分析，反映出mRNA,smallRNA,noncodingRNA等或者其中一些的表達水平。

在過去的十年中，RNA-Seq技術迅速發展，併成為了在轉錄組水平上分析差異基因表達/mRNA可變剪切的不可缺少的工具。隨着下一代測序技術的發展，RNA-Seq技術應用範圍變得更加廣泛：一是在RNA生物學領域，RNA-Seq可以應用於單細胞基因表達/蛋白質表達/RNA結構的分析；二是空間轉錄組的概念也逐漸興起。長讀長/直接RNA-Seq技術以及更好的數據分析計算工具有助於生物學家們利用RNA-seq加深對RNA生物學的理解——例如轉錄何時何地開始；體內摺疊和分子間作用如何影響RNA功能等問題。

中文名: RNA測序
外文名: RNA-Seq
RNA sequencing^[1]

釋義: 轉錄組測序技術
領域: 生物基因領域
目標: 基因測序

RNA-seq簡介

RNA-seq測序和分析(3張)

轉錄組是某個物種或者特定細胞類型產生的所有轉錄本的集合。轉錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結構，揭示特定生物學過程以及疾病發生過程中的分子機理，已廣泛應用於基礎研究、臨牀診斷和藥物研發等領域。

RNA測序最經常用於分析差異表達基因（DEG）。標準的工作流程從實驗室提取RNA開始，到mRNA富集或去除核糖體RNA，cDNA 反轉錄以及製備由接頭連接的測序文庫。接下來，這個文庫會被高通量測序平台測序，每一個樣本通常會被測序到10000000～30000000讀長。最後，實驗得到的數據通過比對或拼接測序的讀長到轉錄組，量化覆蓋轉錄本的讀長，過濾和樣本間歸一化，用統計模型描述每個基因在各個樣本組之間存在什麼樣的表達水平上的差異。

早期RNA-Seq實驗使用組織測序分析差異基因，在不同的生物中都可以分析，比如玉米，擬南芥^[2] ，釀酒酵母，小鼠，人類等。RNA測序可以被當作不同方法或者生物學應用的總稱，其中差異基因的分析始終是RNA測序的主要應用場景，被當做是一個常規的實驗手段。

RNA測序更廣泛的應用場景加深了我們對於很多生物學領域的理解，比如mRNA剪切程度，non-coding RNA以及enhancer RNA對於基因表達的調節。RNA測序的發展被濕實驗和計算方法兩者的進步共同驅動，帶來了RNA生物學豐富而又更加客觀的認識，也讓轉錄組學的發展在之前基因芯片技術的基礎上成為可能。截止2019年，存在眾多不同的RNA測序流程，大多數由Illumina提供，但也有長讀長RNA測序以及直接RNA測序（dRNA-seq）的技術進步解決了Illumina為代表的短讀長測序技術所不能解決的問題。

RNA-seq實驗流程

樣品提取總RNA後，對於真核生物，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，對於原核生物，用試劑盒去除rRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片斷成為短片段，再以片斷後的mRNA為模板，用六鹼基隨機引物(random hexamers)合成cDNA第一鏈，並加入緩衝液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I 合成cDNA第二鏈，經過QiaQuick PCR試劑盒純化並加 EB緩衝液洗脱經末端修復、加鹼基A，加測序接頭，再經瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，並進行PCR擴增，從而完成整個文庫製備工作，構建好的文庫用Illumina HiSeq2000進行測序。