Cre-LoxP重組酶系統

Cre重組酶：於1981年從P1噬菌體中發現，屬於λ Int酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區序列全長1029bp（EMBL數據庫登錄號X03453），編碼由 343 個氨基酸組成的38kDa單體蛋白。它不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能識別特異的 DNA 序列，即 loxP 位點，使 loxP位點間的基因序列被刪除或重組。Cre重組酶有70%的重組效率，不借助任何輔助因子，可作用於多種結構的 DNA 底物，如線形、環狀甚至超螺旋 DNA。它 是一種位點特異性重組酶，能介導兩個LoxP位點（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。

LoxP（locus of X （cross）-overinP1）序列：來源於P1噬菌體，是由兩個13bp反向重複序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結合，13bp的反向重複序列是Cre酶的結合域。其序列如下：

5' - ATAACTTCGTATA - GCATACAT - TATACGAAGTTAT - 3'

3' - TATTGAAGCATAT - CGTATGTA - ATATGCTTCAATA - 5'

Cre重組酶介導兩個LoxP位點間的重組是一個動態、可逆的過程，可以分成三種情況：

1、如果兩個LoxP位點位於一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列；

2、如果兩個LoxP位點位於一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導致兩個LoxP位點間的序列倒位；

3、如果兩個LoxP位點分別位於兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導兩條DNA鏈的交換或染色體易位。

另外，Cre不僅可以識別LoxP的2個13bp的反向重複序列和8bp的間隔區域，而且當一個13bp的反向重複序列或者8bp的間隔區發生改變時仍能識別併發生重組。利用這一特點，人們在構建載體時可以根據需要改造LoxP位點序列，以用於特定的基因突變或修復，增加了該系統的應用範圍。

基於Cre/loxP的基因打靶要分兩步來進行。首先要在胚胎幹細胞的基因組中引入loxP序列，這一步可以通過打靶載體的設計和對同源重組子的篩選來實現。下一步通過Cre介導的重組來實現靶基因的遺傳修飾或改變。Cre/loxP系統既可以在細胞水平上用Cre重組酶表達質粒轉染中靶細胞，通過識別loxP位點將抗性標記基因切除，又可以在個體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就可得到刪除外源標記基因的條件性敲除小鼠。或者將Cre基因置於可誘導的啓動子控制下，通過誘導表達Cre重組酶而將loxP位點之間的基因切除（誘導性基因敲除），實現特定基因在特定時間或者組織中的失活。