葡萄籽提取物

葡萄籽提取物是純天然物質，是迄今發現的植物來源最高效的抗氧化劑之一，試驗表明，其抗氧化效果是維生素C和維生素E的30～50倍。 ^[1] 

原花青素具有極強的活性，能抑制香煙中的致癌物，在水相中對自由基的捕捉能力是一般抗氧化劑的2～7倍，如比α-生育酚的活性高兩倍以上。 ^[1] 

研究發現，在眾多的植物組織中，葡萄籽與松樹皮提取物中原花青素的含量最高，而從葡萄籽中提取原花青素的方法主要有溶劑提取法、微波浸提法 、超聲提取法和超臨界CO₂萃取法等。葡萄籽原花青素提取物中含有很多雜質，需進一步純化才能提高原花青素的純度，常用的純化方法有溶劑萃取、膜過濾及色譜法。 ^[2-3] 

乙醇濃度對葡萄籽原花青素提取率的影響最為顯著，提取時間和温度對葡萄籽原花青素提取率的影響都不顯著。其最佳提取工藝參數為：乙醇濃度70%，提取時間120min，料液比1 : 20。 ^[4] 

靜態吸附實驗表明HPD- 700對原花青素的吸附率最高為82.85%，其次為DA201，為82.68%，其差值相差不大，而且，這兩種樹脂對原花青素的吸附量也相同。在解吸試驗中，DA201樹脂對原花青素的解吸率最高，為60.58%，而HPD- 700對原花青素的解吸率只有50.83%。結合吸附試驗和解吸實驗，確定DA210樹脂為分離原花青素的最佳吸附樹脂。 ^[4] 

通過工藝優化，在原花青素濃度為0.15mg/mL時，流速為1mL/min，以70%的乙醇溶液作為洗脱劑，流速為1mL/min，洗脱劑用量為5BV，可以對葡萄籽原花青素的提取液進行初步純化。 ^[4] 

此法測定的是葡萄籽提取物中的原花青素，其含量用原花青素指數來表示。由於沒有原花青素的標準品，因此此方法測定的只是葡萄籽提取物中原花青素的相對值。 ^[5] 

原花青素在酸性條件下加熱轉化為紅色的花青素。

稱取適量的葡萄籽提取物（約15~ 40mg）用甲醇溶解, 最後定溶於100mL。從中取1mL樣品溶液加到10mL比色管中，然後再加入6mL鹽酸- 正丁醇溶液（5/95，V/V），在97℃下反應40min後，取出迅速冷卻，在550nm處測定其吸光度，以甲醇代替提取物溶液作為空白。 ^[5] 

原花青素指數 = A × 7.0/W。A：吸光度；W：樣品質量（g）。

由於用Bate-Smith法測得的葡萄籽提取物中原花青素指數一般在80~100之間，有時也可能大於100。

由於Bate-Smith法測定的結果重現性很差，並且原花青素在此條件下反應不是很徹底。因此Porter等人對Bate- Smith法進行了改進。Porter法改進之處主要是在試劑中添加了Fe³⁺，以提高反應的程度和顏色的穩定性。此方法測定的也是原花青素的相對含量，結果用PVU（porter value unit）表示。porter法的原理同Bate- Smith法。 ^[5] 

稱取適量的葡萄籽提取物（約10~ 30mg）用甲醇溶解，最後定溶於100mL。從中取1mL樣品溶液加到10mL比色管中，然後依次加入6mL鹽酸-正丁醇（5/95，V/V），0.2mL 2.0%硫酸鐵銨溶液（用2mol.L^-1的鹽酸溶解），在97℃下反應40min後，取出迅速冷卻，在550nm處測定其吸光度，以甲醇代替提取物溶液作為空白。 ^[5] 

PVU = A × 7.2/W。A：吸光度；W：樣品質量（g）。

美國葡萄籽方法評定委員會認為葡萄籽提取物的PVU在250~ 350之間是比較理想的。PVU過低，可能説明該產品中原花青素的含量較低；PVU過高，説明該產品中高聚體原花青素含量較高。但由於porter法不能區分測出的是何種原花青素，所以若一種葡萄籽提取物測出的PVU為300，則該產品可能是低聚體原花青素含量較多，也可能是單體和高聚體原花青素含量較多。

美國葡萄籽方法評定委員會認為上述兩種方法不能作為葡萄籽提取物中總多酚或原花青素的定量分析方法。

此法測定的是葡萄籽提取物中總多酚的含量，一般以沒食子酸作為對照品。此方法的優點是能定量分析提取物中總多酚的含量。缺點是不能區分多酚的種類（例如測定的是單體，還是聚合體）；另外蛋白質、核酸、抗壞血酸等易被氧化的物質也參與此反應，不能辨別葡萄籽提取物是否攙假。由於單體和原花青素反應的係數（factors）不一樣，所以測定的含量和葡萄籽提取物中的真實含量有一定偏差。 ^[5] 

在鹼性溶液中，酚類化合物可以將鎢鉬酸還原（W⁶⁺變為W⁵⁺），生成藍色的化合物，顏色的深淺與多酚含量呈正相關，藍色化合物在760nm處有最大吸收峯。

稱取適量的葡萄籽提取物，用水溶解，濃度在0.1mg/mL左右。取1mL樣品液加到10mL比色管中，然後依次加入1mL去離子水、0.5mL Folin- Ciocalteau試劑、1.5mL 26.7% Na₂CO₃溶液，最後用水定容至10mL，室温下反應2小時，在760nm下測定其吸光度。

以沒食子酸作為對照品，配製不同濃度的溶液，按上述方法反應，測得吸光度。以吸光度對濃度繪製標準曲線。由標準曲線可求得提取物中總多酚的含量（以相當於沒食子酸的含量表示）。 ^[5] 

美國葡萄籽方法評定委員會同意採用此種方法來測定葡萄籽提取物中的總多酚，但同時建議此方法還需進一步完善，以確認單體和原花青素同Folin- Ciocalteau試劑反應的差異。

此法測定的是葡萄籽提取物中黃烷-3-醇的含量，但不能區分其中的單體和聚合體。一般用兒茶素作標準品去定量測定。

在酸性條件下，間苯三酚、間苯二酚、A環的黃烷醇和聚原花青素A環的化學活性較高，其上的間苯三酚或間苯二酚可與香蘭素髮生縮合，產物在酸作用下形成有色的正碳離子，樣品的濃度與產生的顏色呈正相關。 ^[5] 

稱取適量的葡萄籽提取物用一定體積的甲醇溶解，最後葡萄籽提取物溶液的濃度為0.1mg/mL左右。取樣品溶液1mL加到10mL比色管中，然後依次加入2.5mL香蘭素甲醇溶液（1.0% W/V），2.5mL 25%硫酸甲醇溶液。室温下反應15min，在510nm測定其吸光度。

以兒茶素作為對照品，配製不同濃度的溶液，按上述方法反應，測得吸光度，以吸光度對濃度繪製標準曲線。由標準曲線可求得提取物中黃烷-3-醇的含量。

香蘭素檢測法測定葡萄籽提取物中黃烷-3-醇一般是用甲醇溶解提取物，配製試劑。另外也可用冰醋酸溶解提取物，配製試劑，但二者測定的數據有很大差異。用甲醇作溶劑時，香蘭素法測定的是總黃烷-3-醇的量，對於聚合原花青素中所有的黃烷-3-醇的量都能發生此反應。而用冰醋酸用溶劑時，香蘭素法測定的是單體黃烷-3-醇和聚合原花青素末端黃烷-3-醇的量，而聚合原花青素中間的黃烷-3-醇不能被測出。而大多用甲醇作溶劑來測定葡萄籽提取物中黃烷-3-醇的量。同時採用兩種溶劑可大概測出提取物中原花青素的平均聚合度。 ^[5] 

美國葡萄籽方法評定委員會已經同意不採用此方法來檢測葡萄籽提取物中的有效成分。

此法測定的是提取物中每種單體、低聚體、高聚體的含量。但由於對照品的限制以及分析手段的制約，只能測定葡萄籽提取物中單體和某些低聚體的含量。實際應用中只需測定其中的單體含量即可。葡萄籽提取物中主要的單體為兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、表兒茶素沒食子酸酯。 ^[5] 

葡萄籽提取物中單體的含量一般在10.0%左右，最高可達到30.0%。由於葡萄籽提取物成分的複雜性，若樣品未經預處理，HPLC法一般很難把多種單體完全分離開來。所以進樣前，需對提取物進行預處理，以去除其中的高聚體，提高單體的含量。常用的預處理方法有：硅膠柱層析、SephadexLH- 20、Sephadex G25、Toyopeah TSK HW40等柱層析方法。也可採用薄層層析法對樣品進行預處理，一般用甲苯 : 丙酮 : 乙酸 = 3 : 3 : 1（V/V/V）作展開劑。 ^[5]