脆弱類桿菌

1983年Myers等在調查羊羔流行性腹瀉的過程中發現，腹瀉羊羔的糞便可以刺激正常羊羔結紮腸段的分泌反映，經過一系列的實驗，最後確定該分泌反應是由Bf分泌一種能夠刺激羊羔結紮腸段分泌反應的毒素引起，命名為Bf毒素（BFT）。依據能否合成、分泌BFT可將Bf分為產腸毒素脆弱類桿菌（ETBF）和非產腸毒素脆弱類桿菌（Nontoxigenic Bacteroids fragills，NTBF）。

BFT為一種類似於真核生物膠原酶的細胞外鋅-金屬蛋白酶（Zinc-metalloproteinase），分子量約（20000），不耐熱，具有蛋白水解活性。ETBF首先合成一個分子量約為（44 000）的BFT前體物質，前體物質包含三個連續的多肽片段，即前信號肽序列，由18個氨基酸殘基組成，為典型的脂蛋白；193個氨基酸殘基構成的多肽原以及186個氨基酸殘基構成的成熟蛋白質（BFT）。成熟蛋白質從前體物質解離後，被分泌到培養上清液中，多肽原可能與BFT的釋放有關。Rokosz等報道亞抑制濃度（MIC濃度以下）的克林黴素可延緩和減少BFT的合成和釋放[6]。

當今已發現3種BFT異構體，即BFT-1，BFT-2和BFT-3。BFT-1、BFT-2分別由ETBF VPI 13784、86-5443-2-2菌株合成、分泌。BFT-3（Korea-BFT）由Chung和Kato分別於1999年、2000年從韓國和日本分離的ETBF菌株中發現，BFT-1和BFT-2具有92%的相同氨基酸序列，主要差異為：（1）用高辨析率陰離子交換柱純化BFT時，洗滌時所用的NaCl溶液濃度不同，表明兩者所帶的淨電荷量不同；（2）體外實驗表明，F、BFT-2對HT29/C1細胞系的生物活性化BFT-1微弱而持久；（3）二者在SDS-PAGE時表現出不同的電泳特性；（4）二者的抗原性也存在一定的差異。BFT-3與BFT-1、BFT-2分別有21和11個氨基酸的差異，氨基酸序列分析表明BFT-3與BFT-2關係更加密切，主要表現為用高辨析率陰離子交換柱純化BFT時洗滌所用的NaCl溶液和SDS-PAGE時電泳特性相同，但BFT-2缺乏存在於BFT-3C末端的具有疏水，親水兩重性的區域[8]現已有人報道從歐洲分離的ETBF檢測到BFT-3，但檢出率顯著低於亞洲地區，提示BFT具有一定的地區特異性。

BFT編碼基因（bft）位於細菌染色體上一個長約6kb的致病島小於常規致病島，只包含bft和編碼另一種金屬蛋白酶的基因，稱作為mp II，缺乏編碼將毒素運送支靶細胞的分泌系統的基因。部分ETBF可存在雙拷貝致病島基因[9]。Bft有3種等位基因。即bft-1，bft-2和bft-3，分別編碼BFT-1、BFT-2和BFT-3。Bft-1，bft-2鹼基序列相符率為93%，bft-3與bft-1，bft-2具有高度同源性，枋苷酸序列相符率為89%~94%，與bft-2關係更加密切。1999年Franco等發現除致病島外，ETBF還具有一個長度為3kb的致病島側翼區（flanking region）。通過將致病島克隆到II型NTBF（不含致病島及側翼區）和III型NTBF（不含致病島但含有側翼區）後觀察ETBF合成能力的研究發現，致病島和其上游的700bpDNA片段對BFT合成和分泌具有重要的作用[5]。2000年Grosso等利用限制性片段長度多態性分析、基因測序及等位基因特異性PCR等技術檢測66例來自不同類型醖釀的ETBF產腸毒素基因，結果顯示bft-1是最常見的等位基因。約佔分離ETBF菌株的65%，在來自成人糞便的ETBF菌株中更常見，而bft-2主要存在兒童糞便的ETBF菌株。該研究還發現攜帶bft-1或bft-2基因的ETBF產生的具有生物活性的毒素最遠多於攜帶bft-3基因的ETBF[9]。

除引起羊羔腹瀉疾病外ETBF亦可使牛瀆、馬駒和小豬等家畜致病。1987年Myers首先報道從診斷不明確的的散發性兒童和成人腹瀉患者的糞便中分離出ETBF，隨後發現從1歲以下的嬰兒糞便中分離出的ETBF與腹瀉無明顯關係，但ETBF與1至5歲的幼兒腹瀉疾病關係密切。Durmaz 報道BFT可觸發原癌基因表達而與結腸癌的發病相關。

一般認為BFT改變微纖維肌動蛋白的結構，並裂解粘着小帶蛋白，即E-鈣粘素，導致腸上皮細胞間緊密連接的破壞從而增加腸道通透性。Francea等經體外單層人類腸上皮細胞（T84）實驗表明，當BFT作用於T84細胞基底外側時，可出現短暫的、BFT濃度依賴性的Lsc電流（短迴路電流）增強，提示C1-分泌增加。Sanfilippo等報道BFT可刺激結腸腸上皮細胞分泌IL-8，轉化生長因子-β（TGF-β）。腸上皮細胞分泌IL-8和TGF-β的能力在一定程度上決定了腸黏膜損傷程度和預後。

最初用於BFT檢測的方法是動物接種法，但動物對BFT的敏感性存在很大差別，而且動物接種法特異性較差，現已淘汰。

1992年以來，利用BFT能改變人類結腸癌衍生的連續腸上皮細胞系，HT-29/C1細胞（克隆的HT-29細胞）經BFT作用3h後出現圓形變，並且細胞簇散裂，敏感性、特異性分別達到89%和100%，純化BFT靈感度達0。1ng/ml。該方法的主要缺點為HT-29/C1細胞形態改變缺乏客觀評判標準，容易受實驗人員主觀因素的影響；HT-29/C1細胞的培養和厭氧菌的分離鑑定需要複雜的實驗條件和較高的技術要求並且費時。

PCR以BFT為檢測目標，1997年Pantosti等採用HT-29/C1細胞培養和PCR同時檢測113株來自培養物和糞便標本的BFT，結果表明兩者的實驗結果完全吻合，並且PCR的靈敏達105~104CFU/g糞便標本。Kato等用HT-29/C1細胞培養和PCR方法檢測188株從腸道外標本分離的Bf，結果發現35株Bf兩種方法均為陽性，而細胞培養法陰性，兩者的相符率達99%以上。Shetab等報道套用式PCR可將靈敏度進一步提高到103~102CFU/g糞便標本。由於糞便中存在的抑制物可降低PCR的敏感性。為了排除PCR抑制物的干擾，Weintraub等採用特異性單抗包被的磁球捕獲、分離細胞與PCR相結合的IMS-PCR方法直接檢測糞便是的ETBF，將靈敏度提高至0~50CPU/g糞便標本。PCR方法存在的主要問題：糞便及其他腸外標本均含有PCR抑制物，易導致PCR敏感性降低，造成假陰性結果；PCR以bft為檢測目標，如果存在基因不表達或死亡細菌殘骸，則易導致假陰性；PCR 方法費用較高。

此外，單克隆抗體檢測亦具有較高的敏感性和特異性。