等位基因特異性PCR

ASPCR的發展，主要是圍繞提高3’末端鹼基錯配分辨率來進行的。為了提高ASPCR對末端鹼基錯配的分辨力，人們嘗試了許多方法。比如：改換另一條鏈進行分析以規避這些錯配延伸率高的鹼基組合；把控制PCR反應的關鍵成分稀釋到接近極限的濃度；在檢測用引物的3'末端附近人為引入新的錯配；截短Taq DNA聚合酶；利用正配鹼基、錯配鹼基摻入的動力學性質的差異，用腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase)來增強這種差異，從而使信噪比大大提高；以及利用人工修飾的鹼基作為3’末端鹼基來抑制錯配延伸率等等。

Bottema 等（1993）提出兩個解決方案：一是設計引物時，如果引物3'末端可能與樣品模板形成延伸率高的鹼基錯配，那麼可以考慮以其互補鏈作為模板，從而避開這些高延伸率的錯配。二是把控制PCR反應的關鍵成分稀釋到接近極限的濃度。由於錯配延伸效率畢竟比正配延伸要差，在擴增資源極低的情況下，錯配延伸即使發生，也達不到可被顯示出來的水平，因此避免了假陽性結果。但是，這兩種方案都需要大量實驗來對實驗條件進行摸索優化，因此目前已較少被採用。

近期改進方法：

1. 在3‘末端附近引入額外錯配

2. 腺苷三磷酸雙磷酸酶介導的等位基因特異PCR法(apyrase-mediated allelespecific extension, AMASE)

3. 焦磷酸解激活的聚合反應法（Pyrophosphorolysis-activated polymerization, PAP）

4. 改進酶效率

5. 鎖定的核酸技術(locked Nucleic Acid, LNA)

由於PCR過程中引物延伸是3'端開始的，所以3'末端的鹼基對引物的延伸來説處於至關重要的位置。如果這個鹼基與模板互補，則引物能從不間斷延伸，PCR可以正常進行，得到特定長度擴增帶。反之，則不能延伸。所以只要將與正常等位基因所不同的那個突變鹼基安排在引物3'最末端，當用某一含突變序列的引物進行PCR時，如果得到特異擴增帶，表明被測基因含有該種突變。沒有特異擴增帶出現，則表示沒有這種突變。ASA也可以將多個引物在一個反應體系中同時進行（多重ASA），其產物通過CE檢測，就可以完成多個點突變的檢測。