河魨毒素

生物中河魨毒素分佈(3張)

在公元前2500年前的中國和埃及，人們就已知道有些魨形目魚類（河魨）有毒，河魨毒素之名，也因河魨而起。而人們通常所指的河魨（並非河豚）（puffer fish），為魨科魚類，泛指硬骨魚綱、魨形目、魨科的各屬魚類，魨科魚類是最常見的含河魨毒素的水產品。中國的魨科魚類共有54種，其中東方魨屬22種。根據伍漢霖等調查，中國共有35種河魨具有不同程度的河魨毒性，其中，在中國南海分佈的有24種，在中國東海包括台灣沿海分佈的有31種，在中國黃海分佈的有14種，在中國渤海分佈的有10種。少數種類能洄游進入江河，如暈環東方魨（Takifugu coronoidus）、暗紋東方魨（Takifugu fasciatus）、弓斑東方魨（Takifugu ocellatus）、鉛點東方魨（Fugu alboplumbeu）、兔頭魨（Lagocephalus lagocephalus）、橫紋東方魨（Takifuguoblongus）等。這些魚類年產量約在3-4萬噸，佔世界河魨總產量的70%左右。 ^[4-5] 

在河魨體內發現含河魨毒素的器官或組織有肝臟、卵巢、皮膚、腸、肌肉、精巢、血液、膽囊和腎等，其中肝臟含河魨毒素的河魨有34種，卵巢含河魨毒素的有32種，皮膚含河魨毒素的有21種，腸含河魨毒素的有21種，肌肉含河魨毒素的有13種，精巢含河魨毒素的有8種，血液含河魨毒素的有4種，膽囊含河魨毒素的有4種，腎含河魨毒素的有1種。有些種類的河魨，地理分佈不同，其體內毒素分佈的部位會也有所不同，如台灣海域的紋腹叉鼻魨（Arothron hispidus），其肌肉就有毒性了，而在南海海域，肌肉中則沒有河魨毒素分佈；又如東海南部的橫紋東方魨（Takifugu oblongus），僅卵巢、肝臟和腸中含河魨毒素，而在台灣沿海的橫紋東方魨，體內河魨毒素分佈較為廣泛，在卵巢、肝臟、腸、膽囊、精巢、肌肉和皮膚中均有分佈，不同河魨的河魨毒素分佈器官或組織中的河魨毒素量也不同。 ^[6] 

經過對浙江沿海8種河魨的毒性的調查，菊黃東方魨肝和皮膚有很強的毒性，均達到445鼠單位，而黃鰭東方魨各部位的毒性均較低。 ^[8]  暗紋東方魨卵巢從III發育到Ⅵ期。卵巢的河魨毒素含量不斷升高，在V期達到最高。然後下降。肝臟的河魨毒素含量也不斷升高，但毒素含量增加不如卵巢明顯，在性腺發育各個時期，眼球、心臟、脾臟、胃腸、皮中的河魨毒素含量沒有顯著提高。 ^[9]  用河魨毒素單抗檢測蟲紋東方魨（Takifugu vermicularis）的卵巢，發現河魨毒素累積在卵母細胞的細胞核、卵黃囊和卵黃顆粒中，而在凹鼻魨（Chelonodon patoca）的卵巢，河魨毒素累積在卵巢的結締組織和卵母細胞的細胞核中，在蟲紋東方魨、凹鼻魨和墨斑凹鼻魨（Chelonodon nigroviridis）的皮膚中，發現河魨毒素累積在腺體和粘液細胞中。 ^[10-11] 

河魨毒素及類似物不僅存在於各種豚科魚中，還廣泛分佈於各種高等、低等生物中，如雲斑裸頰蝦虎魚（Yongeichthys criniger）、織紋螺（Nassarius spp.）等。 ^[12]  有報道顯示，牡蠣吊筏上的紐蟲體內含大量的河魨毒素、4-表河魨毒素、脱水河魨毒素及3種未知毒素，最高毒性為14734MU/g。這種紐蟲體質量僅為0.2-1.0 g，就足以殺死13000只小鼠。紐蟲的毒性變化很大，認為紐蟲可能通過共生的微生物產生河魨毒素或前體。而自1964年Mosher等首次在河魨魚外的動物蠑螈中發現河魨毒素以來，人們對蠑螈體內的河魨毒素及其大量衍生物（1-Hydroxy-5，11-dideoxytetrodotoxin、6-表河魨毒素）的研究興趣越來越濃，主要集中在闡述這種低等動物的代謝途徑。 ^[13]  從粗皮漬螈Taricha granulosa體內分離出河魨毒素的10,7內酯型，該成分在河魨毒素合成的第十五步環節中作為前體物質，故研究蠑螈的代謝途徑將有助於更好地解釋河魨毒素的起源。從亞歷山大藻培養液中檢出一定量的河魨毒素，表明亞歷山大藻體內麻痹性毒素和河魨毒素同時存在。Kodama等認為這種麻痹性貝毒的生產者—亞歷山大藻，可能是河魨毒素的來源。即亞歷山大藻也是貝類中河魨毒素毒性的來源，當亞歷山大藻大量繁殖時，貝類體內也積累着高含量的河魨毒素。 ^{[5]  [14]} 

其他含有河魨毒素的生物有一個共同點，即其體內含有多種能分泌毒素及其類似物的細菌。已從海藻、花紋愛潔蟹（Atergatisfolridus）、多棘槭海星（Astropecten polyacanthus）、圓尾鱟（Carcinoscorpius rotundicauda）、蟲紋東方魨（Fugu vermicularis）和星點東方魨（Takifugu niphobles）、腹足動物（Niotha clethrate）、紐蟲動物中陸續分離到產TTX的細菌，淡水沉積物中也有此類菌、海洋沉積物中分離的鏈黴菌（Streptomycessp.）能產TTX及其衍生物、海膽（Meoma ventricosa）中分離的致病菌VL21也被證實有產毒能力。產TTX的微生物類羣有弧菌屬（Vibrio）的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、希瓦氏菌屬的腐敗希瓦菌（Shewanella putrefaciens）、交替單胞菌（Alteromonas）、芽孢桿菌（Bacillus）、放線菌屬的鏈黴菌（Streptomyces）。 ^[15] 

河魨毒素（tetradotoxin，簡寫為TTX）系小分子量非蛋白質神經毒素，中毒潛伏期短，死亡率高，毒素吸收後迅速作用於末梢神經和中樞神經系統，使神經傳導產生障礙，首先感覺神經麻痹，而後運動神經麻痹，嚴重者腦幹麻痹導致呼吸循環衰竭。河魨的表皮、內臟、血液、睾丸、卵巢、肝、脾、眼球等不同組織中含有河魨毒素（tetrodotoxin，TTX），它是一種劇毒的非蛋白神經毒素。其分子式為C₁₁H₁₇O₈N₃，分子量為319.27，該神經毒素經腹腔注射對小鼠的LD₅₀為8μg/kg。TTX的化學性質穩定，一般烹調手段難以破壞。 ^[17-24] 

河魨毒素結構式(6張)

河魨毒素是一種重要的天然毒素。1909年日本學者田原純首先從河魨魚中發現，並定名Tetrodotoxino 1950年-1957年間，橫尾晃、津田藤介等人首先從紅鰭東方魨，紫色東方魨卵巢中獨立地分離到了結晶態的河魨毒素。其為無臭、易潮解的白色結晶體。該毒素結構的測定由Woodward（哈佛大學）、平田和後藤（名古屋大學）及津田小組（東京大學一三共中央研究所）等分別完成。1964年在京都召開的國際天然產物化學會議上同時報告了TTX的正確結構，是一種分子量不大，但結構很複雜的籠形原酸酯類生物鹼，分子中幾乎所有的碳原子均有不對稱取代。因此它也被稱為“自然界最奇特的分子之一”。 ^[25] 

TTX是一種氨基全氫喹唑啉型化合物，為白色結晶，無臭無味，微溶於水，不溶於有機溶劑；對酸作用穩定，對鹼極不穩定；沒有確定熔點，220℃以上炭化。TTX的結構特徵是有1個碳環，1個胍基，6個羥基，在C-5和C-10位有一個半醛糖內酯連接着的分開的環。在胰液酶、唾液澱粉酶、乳化酶、糖轉化酶等酶類存在下不分解。只溶於酸性水或醇溶液，在鹼水溶液中易分解，在5%氫氧化鉀溶液中於90-100℃下可分解成黃色結晶。它是相當特殊的一種有機化合物，分子內的胍基與氮原子是質子化的，正羰酸也離解為陰離子，所以河魨毒素是以內鹽形式存在。在室温下用50 g/L的氫氧化鋇處理河魨毒素可得脱水河魨毒素—由pK_a1值為2.5的羧基和pK_a2值為10.9的胍基組成的兩性離子化合物，其可在水中與一分子的溴完全反應產生河魨酸。河魨毒素在酸中也能部分異構化為脱水錶河魨毒素，從而影響對河魨毒素的提取純度。所以，河魨毒素製劑經過長時間放置可降解。至於河魨酸是否具備毒性尚有爭議。因此，在生物代謝過程中，脱水和脱氧過程會降低毒性，而加氧機制能夠使毒性增強。 ^[27] 

河魨毒素合成示意圖(4張)

在河魨魚中，河魨毒素與其同系物是同時存在的。 ^[28]  河魨毒素的同系物種類較多，從河魨、紐蟲、兩棲類等生物體內分離得到的同系物包括：4-epiTTX，6-epiTTX，11-deoxyTTX，11-deoxy-4-epiTTX，11-norTTX-6(R)-ol，11-norTTX-6(S)-ol，11-norTTX-6,6-diol，4,9-anhydroTTX，11-oxoTTX，4,9-anhydro-4-epiTTX，4,9-anhydro-11-deoxyTTX，5-deoxyTTX，tetrodonicacid，4,9-anhydro-6-epi-TTX、5,6,11-trideoxyTTX、4-CysTTX等。 ^[29]  這些同系物可能與河魨毒素的代謝或生物合成有關。在河魨毒素的同系物中，5-deoxyTTX、5,6,11-trideoxyTTX、4-CysTTX、4,9-anhydroTTX、4,9-anhydro-6-epi-TTX、河魨酸等同系物的毒性較低，甚至無毒，而11-oxoTTX雖比較罕見，其毒性卻是TTX的4-5倍。 ^[30]  它們與河魨毒素性質相似，有一定的生理活性，如：河魨毒素的小鼠LD₅₀為10μg/kg，6-表河魨毒素為60μg/kg，11-去氧河魨毒素為71μg/kg。 ^[31] 

TTX具有鎮痛、降壓、抗心律失常、局麻、戒毒及抑瘤的功效。對河魨毒素的提取分離研究首先是晶化問題。自從田原於1909年首次分離到TTX的粗素以來，經過了40年，直到橫尾（1950）、津田（1952）、荒川（1956）、平田（1957）等人，才分離出TTX結晶，其分離方法分別為：橫尾法（氧化鋁柱層析），津田—河村法（圓形濾紙層析法），津田—河村大規模生產法（活性炭層析法），平田—後藤法（離子交換樹脂—活性炭吸附法）等。通常TTX的提取步驟是：河魨卵巢—水提取—除蛋白質—離子交換—脱色—活性炭吸附—濃縮—精製—結晶。現代分離河毒素多采用層析法，其具體方法如下：首先，把富含毒素的樣品絞碎，與含1%醋酸的甲醇液一起勻漿以抽提河毒素，勻漿液經5000-6000r/min，離心10-15min，沉澱物再用以上方法重複兩次。合併上清液，減壓濃縮，並用氯仿除去脂肪。之後經過冷凍乾燥或再減壓濃縮，濃縮液經Bio-Gel-P2或CM-Sephadex C-25（NH₄⁺）或Amberlite IRC-50（NH₄⁺）層析，用0.1-0.4 mol/L醋酸洗脱，合併有毒成分，濃縮後再經Bio-Rex70（H⁺）層析，以0.1-0.3mol/L醋酸洗脱，然後再重複一次，Bio-Rex70（H⁺）柱層硒，即可得到純度非常高的樣品。 ^[33] 

河魨毒素離子譜圖(3張)

1982年，美國植物學家韋德-戴維斯發現，海地巫毒教中的回魂大師在藥物中使用含有從河魨提取的毒素粉末，整個過程裏中毒者大腦能完全保持清醒，如果能挺過24h，他們就會很快恢復正常，且不會出現併發症。使人們相信他們有使人“死而後生”的能力，即所謂的“還魂術”。其實，這是由於河魨毒素的特殊結構使其像塞子一樣，凝固在神經軸突的鈉離子通道的入口處，阻礙鈉離子透過細胞膜傳導神經的衝動，從而關閉神經系統。由於河魨毒素不能越過大腦中血液細胞的屏障，因此受害者就會處於大腦清醒的無助狀態之中。幾小時或幾天過後，當河魨毒素最終開放鈉離子通道時大多數受害者已經死亡。 ^[36] 

TTX是典型的鈉離子通道阻斷劑，它能選擇性與肌肉、神經細胞的細胞膜表面的鈉離子通道受體結合，阻斷電壓依賴性鈉離子通道，從而阻滯動作電位，抑制神經肌肉間興奮的傳導，導致與之相關的生理機能的障礙，主要造成肌肉和神經的麻痹。構效關係表明，TTX的活性基團是1,2,3 位的胍氨基和附近的C-4，C-9，C-10位的羥基，胍基在生理pH值下發生質子化，形成正電活性區域與鈉離子通道受體蛋白的負電性羰基相互作用，從而阻礙離子進入通道。鈉離子受體至少有6個特異性靶分子結合位點，TTX是與鈉通道受體部位I結合。TTX受體位於可興奮細胞膜外側、鈉通道外口附近，TTX與受體部位結合，阻礙鈉離子接近通道外口。研究表明，TTX特異性作用於鈉通道，對鉀、鈣通道和神經肌肉的突觸及膽鹼指酶無直接影響。此外，毒素能通過血腦屏障進入中樞，對中樞產生明顯的抑制作用。總的來説，TTX對呼吸和心血管的抑制是對中樞和外周的共同作用結果。 ^[32] 

河魨毒素毒理作用的主要表徵是阻遏神經和肌肉的傳導。除直接作用於胃腸道引起局部刺激症狀外，河魨毒素被機體吸收進入血液後，能迅速使神經末梢和神經中樞發生麻痹，繼而使得各隨意肌的運動神經麻痹；毒量增大時會毒及迷走神經，影響呼吸，造成脈搏遲緩；嚴重時體温和血壓下降，最後導致血管運動神經和呼吸神經中樞麻痹而迅速死亡。TTX可選擇性地抑制可興奮膜的電壓，阻礙Na⁺通道的開放，從而阻止神經衝動的發生和傳導，使神經肌肉喪失興奮性。 ^[35]  此後，多數研究工作都是圍繞着TTX阻斷可興奮組織的Na⁺通道而展開。河魨對TTX具有抵抗力和免疫性。如果該區域出現由芳香性氨基酸向非芳香性氨基酸的氨基酸置換，就會顯著影響它與TTX結合的靈敏度。在對河魨毒素沒有免疫力的生物體內，鈉通道的α-亞基上存在河魨毒素的受體，河魨毒素與α-亞基門孔附近的氨基酸殘基結合，阻止鈉離子進入細胞內，引起河魨毒素中毒 ^[37]  。而河魨體內細胞的構造與其他生物不同，河魨體內還存在可以與河魨毒素結合的其他蛋白質，從而使河魨對體內的河魨毒素具有免疫力。比較紅鰭東方魨（Fugu rubripes）、黑青斑東方魨（Tetraodon nigroviridis）和斑馬魚的基因序列圖譜，發現紅鰭東方魨和黑青斑東方魨骨骼肌的Nav1.4通道發生了變異，正是這種變異使河魨具有抵抗河魨毒素的能力。紅鰭東方魨和豹紋東方魨的變異類似，都是在Nav1.4通道的401位點上發生了取代，取代為一個摺疊程度更高的不飽和氨基酸。 ^[34]  河魨的這些氨基酸是不與河魨毒素結合的，從而也就不能對河魨的鈉通道造成影響。通過克隆調控豹紋東方魨骨骼肌Nav1.4通道表達的cDNA，發現Nav1.4通道區域Ⅰ401位點處存在一個不飽和氨基酸，即天冬醯胺。通過基因工程把不飽和氨基酸移植到對河魨毒素敏感的小鼠骨骼肌Nav1.4通道處，移植的不飽和氨基酸的摺疊程度越高，小鼠抵抗河魨毒素的能力越強。當不飽和氨基酸的摺疊程度大於取代位點氨基酸摺疊程度的2500倍時，IC50（50%Na⁺通道發生阻斷時河魨毒素的濃度）提高至47μmol/L。 ^[38] 

一些生物對河魨毒素的耐受性與其獨特的鈉離子通道結構有關。研究發現，3×10^-6M的河魨毒素對Arothron hispidus等7種河魨魚肌肉的動作電位沒有影響，而3×10^-7M的河魨毒素卻阻斷了3種不含河魨毒素的其他魚的動作電位。河魨毒素的結合位點位於鈉離子通道內高度保守的成孔區域（P-loop），對河魨毒素敏感的鈉離子通道（TTX-sensitiveNa⁺ channel）在該區域有與TTX高度親和的芳香性氨基酸。 ^[39]  如果該區出現由芳香性氨基酸向非芳香性氨基酸的氨基酸置換，就會顯著影響其與TTX結合的靈敏度，從而使鈉離子通道成為抗河魨毒素的鈉離子通道（TTX-resistantNa⁺ channel）。通過對河魨魚（Fugu pardalis）骨骼肌Nav1.4通道的cDNA基因序列圖譜的研究發現，通道的結構域I的成孔區域的401位置包含有一個非芳香氨基酸，即天冬醯胺酸，而此位點發生的氨基酸置換可能與河魨魚對高濃度的TTX耐受有關。在捕食與防禦的長期進化過程中，在北美西部，一些束帶蛇對河魨毒素也具備了一定的耐受力，而且，不同地區的束帶蛇對河魨毒素的耐受力也有明顯差異。對這些束帶蛇的Nav1.4通道進行分析發現，他們的芳香氨基酸在401位點是保守的，但在結構域IV的成孔區域發生了幾處氨基酸置換。 ^[40]  在WillowCreek地區的束帶蛇的Nav1.4通道的結構域IV包含有3個氨基酸的置換，該地區束帶蛇對TTX的耐受力比Benton地區的高兩個數量級，因為後者只包含1個氨基酸替代。只在河魨魚與束帶蛇中發現它們對河魨毒素的耐受性與其骨骼肌和神經元的鈉離子通道發生了氨基酸替代有關。這兩種生物之間的一個主要差別就是，幾乎所有的河魨魚對TTX都有一定的耐受性，而且有相同耐受機制，但是隻有一部分束帶蛇具有對TTX的耐受力。 ^[41] 

主張內因説的學者認為，河魨等生物體含有的刺胞、毒腺中的蛋白質毒素是內源性毒素的來源。他們推測河魨魚體內有特定功能或微生物，能將攝入的食物轉化為毒素。但始終沒有更多證據證實這種説法，因此內因説沒有得到廣泛認可。不少研究者認為，許多海洋細菌能產生河魨毒素，作為河魨魚類食物的一些動物，如海星等也含有河魨毒素，而人工飼養的河魨卻沒有河魨毒素，表明河魨本身並無產生TTX的能力。但後來河魨毒素由細菌產生的觀點遭到了反駁，Kmatsumura在1995年就發現從解藻朊酸弧菌（Vibrio alginolyiicus）中提取出來的河魨毒素並沒有與河魨毒素的單克隆抗體發生反應，認為生物鑑定法存在弊端，因此有必要重新認識“TTX是由細菌產生的”這一觀點。為了證實產生河魨毒素的原因是內源性的，Kendo於1998年提取了星點東方魨成熟的卵細胞進行人工授精及胚胎培育，發現在孵化過程中胚胎體內河魨毒素的含量一直在增加。這表明增加的毒素是胚胎的產物。由此可知，河魨體內的TTX可能並非直接來源於細菌，而是河魨本身與其體內共生細菌共同的產物。河魨等動物自身是否具有分泌毒素的功能，以及河魨毒素如何在機體各器官內發生轉移等，還有待進一步研究。 ^[42-44] 

而且，河魨毒素在河魨之外的物種分佈，和河魨體內細菌能分泌河魨毒素等現象，不能説明河魨本身不能產生河魨毒素。Matsumura就對河魨毒素的細菌起源提出了質疑，他發現弧菌（Vibrioalginolyticus）所產的河魨毒素並不能和河魨毒素的單克隆抗體反應，説明細菌產生的河魨毒素與河魨體內的河魨毒素並不完全相同。 ^[45]  但細菌產生的河魨毒素同樣能使小鼠致死，説明其可能是河魨毒素的衍生物。但是，內源假説同樣不能解釋一些事實，僅在投餵配合飼料的條件下，人工養殖的河魨體內的河魨毒素沒有或含量很低，此事實很難用內源假説來解釋。Matsui等認為河魨體內有一種能夠儲藏TTX的機制。但是，如果河魨僅僅能儲藏河魨毒素，同樣也難以解釋胚胎髮育過程中河魨毒素含量一直在增加的現象。 ^[46]  因此，河魨體內的河魨毒素極有可能是河魨與其體內共生細菌共同的產物，體內共生細菌產生河魨毒素的衍生物，河魨把此衍生物轉化為河魨自身的河魨毒素。河魨胚胎髮育過程中河魨毒素含量一直在增加，可能是共生細菌產生的河魨毒素衍生物，在卵子受精前就已經累積在卵中，受精後的胚胎髮育過程中，河魨胚胎逐漸具備把此衍生物轉化為自身河魨毒素的能力。因此，胚胎髮育過程中河魨毒素含量可持續增加。 ^[47-49] 

在Mosher等從加州蠑螈（Tarichatorosa）中分離到河魨毒素以前，河魨毒素一直被認為是河魨產生的，之後，在蝦虎魚、蛙類、馬蹄蟹、海星、紐蟲、箭蟲、環節動物、石灰質藻類等中均分離到河魨毒素，使人們相信河魨毒素的分佈比較廣泛。1986年，Noguchi等首次報道了從花紋愛潔蟹（Atergatisfloridus）的腸道內分離到一種產河魨毒素的細菌，1987年，Noguchi等從蟲紋東方魨腸道中也分離出能產河魨毒素的細菌Vibrio alginolyticus，此後，從各種動物的多種動物體內或體表、海洋沉積物、淡水沉積物中也分離到了產河魨毒素及其衍生物的各種微生物，這些發現，使人們更加相信河魨體內河魨毒素的體外起源假説，日本的清水、松居是最早提出“外因説”的學者。他們用含TTX的餌料飼餵人工養殖的無毒河魨及人工採苗後飼養的河魨，結果這些無毒河魨發生毒化現象。由此推測，毒素的起源可能是外因性的。該假説認為河魨體內河魨毒素來源於環境中的河魨毒素或產河魨毒素的細菌。 ^[50-54] 

Noguchi等採用小鼠和液相-質譜技術調查了日本1990到2003期間在離開海底10米以上的網箱養殖紅鰭東方魨的河魨毒素毒性情況，在肝臟、皮膚、肌肉、性腺中均沒有檢測到河魨毒素（檢測靈敏度<0.1MU/g），表明餵養人工配合飼料的紅鰭東方魨沒有毒性，説明可以通過遠離海底沉積物能有效培養無毒的紅鰭東方魨。 ^[55]  而Hwang等發現，不同水質對人工養殖的紅鰭東方魨的毒性往往是有影響的，在台北宜蘭縣兩個養殖基地養殖的紅鰭東方魨是無毒的，而在毗鄰的台北縣養殖基地養殖的紅鰭東方魨的卵巢在1-3月是有毒的，肝臟在1-3月是有弱毒的。 ^[56]  江蘇宜興人工養殖的暗紋東方魨所有受檢的器官組織均是無毒的。採用投餵配合飼料和在淡水環境養殖暗紋東方魨，其1-3齡均為無毒或低毒。 ^[57]  華元渝等採用高效液相色譜儀和熒光分光光度計聯合法隨機抽樣檢驗經過純全人工繁殖、苗種培育至商品魚的暗紋東方魨毒性，結果表明其體內4種組織器官中的河魨毒素平均含量低於2μg/g，屬基本無毒。 ^[58] 

Nagashima等提出河魨體內的毒素是通過食物鏈富集的，河魨肝臟的薄切片吸收河魨毒素的能力比其他魚類肝臟的薄切片要強。實驗也證明，人工養殖的河魨不含河魨毒素，但是在飼料中添加有毒河魨的肝臟，養殖河魨體內就含有河魨毒素。大多數學者認為河魨體內的河魨毒素是受食物鏈和微生物雙重影響的結果。 ^[59] 

在河魨毒素起源方面研究得最多的是東方魨。一般認為，降海洄游的河魨產生河魨毒素的可能性有以下幾種：（1）東方魨下海後在海水環境中自身產生TTX；（2）海水中某些生物含有TTX，被河魨吞食後吸收並儲藏、濃集於體內；（3）許多海洋生物的代謝產物中含有TTX。從研究來看，河魨自身產生河魨毒素的可能性不大，因為除了河魨外，海洋中還有許多河魨喜食的生物體內都含有TTX。另外，生存於淡水中未經降海洄游的河魨體內檢不出TTX，也説明河魨自身不產毒。但在投餵含TTX的飼料一段時間後，其體內又能檢出TTX。因此，TTX很有可能是通過食物鏈在河魨體內聚集的。而且，海洋中許多含毒細菌黏附於河魨喜食的生物體表，進入河魨體內後就與其形成互利共生的關係，河魨可通過皮膚腺的暴露來釋放TTX，從而起到抵禦天敵的作用。 ^[60] 

在對麻痹性貝毒導致蟹類毒化的機制的追蹤過程中，從石灰藻及毒蟹內臟中分離到了可產生毒素的細菌，經鑑定，它們是假單胞菌屬（Pseudomonassp.）細菌。 ^[61]  從該菌培養液中得到的兩種毒素，經FLD-HPLC法及紅外光譜、質譜分析法分析，確證為TTX及脱水TTX。進一步將其分別注射入小鼠腹腔，顯示了與TTX和脱水-TTX相對應的致死率，從而確證TTX為細菌的代謝產物。從4種毛顎動物（Chaetognatha）體內分離到34株弧菌屬（Vibriosp.）海洋細菌，其培養物和胞外產物均可阻斷Na⁺通道。經組織培養法及液相色譜等方法同樣確證該產物為TTX。 ^[62]  由此可見，產TTX的細菌是多樣性的。吳韶菊等通過分離和篩選河魨各個器官內的細菌，從36種細菌中挑選出了20種能分泌TTX的細菌，並發現卵巢和肝臟中TTX的含量高，其內部所含的菌株數量和毒性也都比其他組織高，從而説明河魨所含的TTX與其共生細菌密切相關。 ^[63] 

河魨毒素的“體外起源”假説假定所有能產生TTX的生物都與其體內能分泌TTX的微生物有着密切聯繫，並且已被隨後從各種攜帶TTX的生物體內提取出來的能產生TTX的細菌所證實。另外，TTX的累積機制不僅可通過食物鏈獲得，也能由其自身腸道內的細菌產生，因為海洋中有些生物也攝食與河魨同樣的食物，但它們的體內並不含有TTX，從而估計河魨體內有一種能夠儲藏TTX的機制。大多數研究者都認為，河魨體內的TTX是受食物鏈和微生物雙重影響的結果。 ^[64] 

河魨體內TTX的含量不僅存在個體間的差異，並且其體內各組織中TTX的含量也存在明顯的差異。一般卵巢和肝臟中含量最多，精巢次之，皮膚和肌肉中則是微量或沒有。將河魨的肝臟組織培養在含TTX的培養液中，發現它能吸收TTX，證明河魨肝臟並不能分泌TTX，而是吸收體外的TTX。這也進一步證明了河魨體內的TTX是外源性的。 ^[65] 

有學者從免疫學的角度對河魨富集河魨毒素的機制進行了解釋。用河魨毒素做生物免疫實驗，用相同濃度的河魨毒素微量注射於有毒河魨、無毒河魨和小鼠體內做毒性實驗。結果發現，有毒河魨對河魨毒素的免疫耐受能力最強，無毒河魨的免疫耐受能力比小鼠的強。由此推斷，有毒河魨對河魨毒素具有特殊的免疫耐受調控機制。也有學者從分子生物學角度進行了論證。 ^[66]  研究認為，在河魨體內存在一種蛋白質，可與河魨毒素聯結形成複合物，也已經從星點東方魨中提取出了河魨毒素與蛋白質聯結形成的複合物。 ^[67]  從河魨肝臟內提取mRNA，逆轉錄得到cDNA，通過cDNA末端擴增，發現cDNA中纖維蛋白原基因（flp）的含量與河魨毒素的毒力水平呈線性關係。由此可以推斷，河魨體內的河魨毒素是與蛋白質聯結在一起以複合物的形式存在，並且河魨毒素的含量是受基因調控的。人們對河魨富集河魨毒素的機理從不同的角度進行了論證，但沒有形成統一的觀點。不過養殖的河魨毒性較低，這為開放河魨魚市場提供了理論依據。 ^[68] 

河魨毒素在發現之初人們就在不斷尋找其更好的檢測方法。河魨毒素檢測常用的方法有小鼠檢測法、酶聯免疫法、薄層色譜法、柱後衍生高效液相色譜檢測法、氣質聯用法和液質聯用等。國外較多地採用氣質聯用、液質聯用的方法檢測河魨毒素。 ^[69-72] 

小鼠生物法（以30分鐘內將一體重20克小鼠致死所用河純毒素的量為一鼠單位）是最常用、最直觀的檢測方法，通過小鼠死亡前所呈現出的典型的河魨毒素中毒症狀，可迅速地將河魨毒素與其它致死性物質區分開。最早對河毒素進行定量分析研究是在1941年，當時斯坦福大學在研究蠑螈毒素時引進了鼠單位（Mouse unit，MU）概念。其原理是，一定體重的小鼠經腹腔注射TTX後，其死亡時間的倒數與注射TTX劑量之間存在着線性關係，因此可根據小鼠死亡時間推斷TTX的含量。此法測得的毒力用小鼠單位（mouse unit，MU）表示。黃登福等採用同樣的方法，使用ICR品系小鼠建立了測試TTX毒素的方法，1MU=0.178μgTTX。但實際使用時因個體差異大、重現性不好，而且需有一定規模才能客觀反映實驗結果，因此該法的應用受到限制。 ^[73-74] 

免疫酶技術是20世紀60年代發展起來的新的免疫測定法，它是抗原抗體的免疫反應與酶的高效催化作用原理的有機結合。於1989年建立了用牛血清白蛋白（BSA）連接河魨酸（TDA）作為抗原的酶聯免疫吸附檢測（ELISA）法，檢出限為0.3-1000.0mg/L。 ^[75]  應用小鼠生物試驗和間接競爭抑制酶聯免疫吸附試驗（ELISA）同步檢測17份河魨肝組織和20份河魨肌肉組織中的河魨毒素含量，並對2種方法的檢測結果進行比較。結果表明，ELISA法與小鼠生物試驗法測得的結果相符合。由於ELISA法測定程序簡便易行，速度快，靈敏度高，因而在河魨毒素的定量檢測以及預防河魨中毒方面具有廣泛的應用前景。 ^[76] 

HPLC譜圖(2張)

高效液相色譜是分析、製備領域應用最為廣泛也最為成熟的技術之一，它具有分離效率高、分辨率好及速度快等特點。張虹等採用醋酸與TTX結合形成離子對在ODS柱上採用紫外檢測器直接測定TTX含量，該方法操作簡單、快速、準確，最低檢測限50ng。 ^[77]  還利用蒸發光散射檢測器進行TTX測定，該法可用於微克水平河魨毒素含量的測定。劉海新等採用柱後衍生高效液相色譜法檢測水產品中的河魨毒素含量，樣品先由0.1%乙酸提取，再經過C18固相萃取柱淨化。以庚烷磺酸鈉為離子對試劑，應用反相離子對液相色譜分離河魨毒素，採用在線柱後衍生系統，熒光檢測器定量檢測。河魨毒素在5-1600ng的範圍內呈良好的線性相關，相關係數r=0.9997；1、2、8μg/g，3個濃度水平添加樣，日內和日間的回收率為80.9-91.2%，相對標準偏差為1.93% -5.57%；方法定量限為1μg/g。高效液相色譜熒光檢測器要比紫外檢測器具有更低的檢測限，而TTX沒有熒光吸收，所以必須先要衍生化成具有熒光吸收的物質，操作比較繁瑣。 ^[78-80] 

河魨毒素質譜圖(2張)

隨着質譜技術的發展，質譜所具有的超強定性能力使色譜質譜聯用成為分析行業最有效最準確的分析方法之一。1993年SaitoT利用氣-質聯用從刀魚中檢測到TTX及其同分異構體的存在。Nagashima等利用氣-質聯用從暗紋東方魨肝臟含有的高分子物質中檢測到河魨毒素的存在。吳平谷等用2%乙酸/甲醇提取出河魨毒素，用正己烷脱脂，然後用鹼將河魨毒素水解成2-氨基-8-羥基-6-羥甲基-喹唑啉（C9鹼），水解液經過C18、SLH固相萃取柱淨化，BSTFA衍生，採用氣相色譜—質譜法全掃描方式測定。液相色譜質譜法比氣相色譜質譜法具有更廣的應用範圍，不需要衍生化，大大簡化了分析手段。 ^[81]  採用了液相/質譜聯用法來測定河魨中的TTX。 ^[82]  李愛峯等應用C18反相色譜柱和HILIC親水作用色譜柱，建立了河魨毒素（TTX）的液相色譜—電噴霧離子阱質譜聯用分析方法。 ^[83]  鄭雍怡等建立了在大鼠腹腔注射給藥後，測定其血漿中河魨毒素的高效液相色譜—質譜聯用（LC/MS）定量檢測方法。 ^[84]  建立了LC-MS-MS測定血漿中河魨毒素的檢測方法，其檢測限濃度為1ng/mL。 ^[85] 

熒光法是最早建立的定量檢測TTX的儀器分析方法。1976年，Saito等首先提出了熒光法，原理是加鹼水解後生成2-氨基6-羥甲基8-羥基喹唑啉（簡稱C9鹼），該物質發熒光，建立了最早的熒光分析法；其後，又有研究對熒光檢測法進行了改進，建立了連續自動熒光分析方法。 ^[86]  但由於熒光分光光度計在中國應用不如紫外分光光度計普遍，因此根據TTX鹼水解生成C9鹼的同時定量地生成草酸鈉，此結構在紫外區有明顯吸收峯的特點，陳玉仁等建立了紫外分光光度法。該法與熒光法相比，二者最低檢出限接近，但後者儀器設備較便宜。 ^[87] 

河魨毒素色譜圖(11張)

Nagashima等建立了薄層色譜快原子轟擊質譜的測定方法。先在LHP-K板上進行TLC，純化TTX及其衍生物，然後用質譜定量，最低檢出限為0.1g。此法可以區分在其它TLC方法中難以區分的TTX和脱水TTX，其優點還在於不需TMS硅烷化，甚至當被測物的TLC行為不清時也可以測定。 ^[88]  1988年，王健偉研究建立了不需水解的薄層色譜（TLC）分析方法用於TTX的定量檢測。採用火焰離子檢測器，不需將TTX降解為C9鹼，避免了衍生反應過程中可能存在的干擾。 ^[89] 

河魨毒素的顯著作用之一是產生嚴重的低血壓，5×10^-4μg·g^-1就可產生降壓作用。實驗證實，在α和β腎上腺素受體阻斷劑存在時，TTX具有血管舒張作用。TTX使血管逐漸麻痹，外周血管阻力減小，造成血壓下降。在培養的牛腎上腺髓質細胞，TTX尚可抑制腎上腺細胞釋放兒茶酚胺。儘管腹腔注射極微量TTX（4×10^-4μg·g^-1）不影響猴的收縮壓和舒張壓，當微量的TTX與心得安合用時可短時降低舒張壓；與戊脈安合用時能降低收縮壓和舒張壓。國產河魨毒素0.05×10^-3~2.0×10^-3μg·g^-1給家兔靜脈注射、0.5×10^-3~2.0×10^-3μg·g^-1給大鼠靜脈注射均能產生降壓作用。離體血管及離體心臟實驗證明，TTX無直接擴張血管作用，但可明顯抑制心臟，推測河魨毒素的降壓作用與抑制心臟作用有關。 ^[90] 

河魨毒素中毒所致昏迷患者中有“假性昏迷”的存在。假性昏迷的原因推測為：運動神經肌肉接頭處被阻滯，出現四肢癱瘓、腱反射消失、壓眶反射消失及周圍性呼吸肌麻痹；部分腦幹受抑制，而大腦皮質未受到完全抑制，導致四肢癱瘓、血管運動中樞和呼吸中樞麻痹。確切機制仍需進一步探討。 ^[91] 

由於河毒素獨特的作用機制，使人們對其結構產生了濃厚興趣。因此，通過對毒素分子母核的研究，有可能人工合成一系列控制神經肌肉細胞膜作用機制的藥物。臨牀上，河毒素針劑可以代替嗎啡、杜冷丁、阿託平和南美筒箭毒等，用於治療神經痛，鎮痛的時間可達12-20h。河毒素的毒性較大，在使用上受到一定限制，但在臨牀上可有以下幾方面的用途：（1）鎮痛，含TTX的注射劑曾用於治療神經痛、癌痛、關節痛、肌肉痛、麻瘋痛以及因創傷、挫傷、燒傷引起的疼痛。（2）局部麻醉，由於河毒素的麻醉作用比一般的局部麻醉藥要強上萬倍，故國外已有河毒素與普通麻醉藥配伍而作為麻醉藥的專利出售。（3）鎮靜，可用作瘙癢鎮靜劑，對於皮膚瘙癢症、疥癬、皮炎等可以止癢，進而促使其痊癒。也可用作呼吸鎮靜劑，治療氣喘和百日咳等症。（4）鎮痙，作為解痙劑，用於鬆弛肌肉痙攣、胃痙攣和其它痙攣，對破傷風痙攣的解痙效果尤為顯著。（5）降壓，河毒素有獨特的降血壓效果可以考慮在臨牀上用來搶救高血壓患者。（6）抗心律失常，河毒素有明顯的抗心律失常活性，若與其他抗心律失常藥物配用，可顯著增強對心律失常的療效。（7）其他，作尿意鎮靜劑，用於遺尿症的治療，對男性陽痿及婦女性慾缺乏症等也有一定的療效。 ^[92-93] 

毒素與實驗鼠作用關係(5張)

神經生物學家證實微量毒液就有治療作用。河魨毒素也可作為局部麻醉藥，其局部麻醉作用比一般麻藥強。國外已有將河魨毒素與普通麻藥配伍作為局部麻藥的專利出售。河魨毒素對癌痛的鎮痛也很有效。研究人員發現癌症病人24h持續杜冷丁治療收效甚微，而注射河魨毒素，每天2次，連續3天疼痛便緩解。河魨毒素不僅可以有效緩解晚期癌症引起的劇烈痛楚，還可治療頑固性哮喘等。中國研究人員發現，河魨毒素還是一種戒毒良藥。研究人員對吸毒者進行試驗，在注射極微量的河魨毒素後，所有各種“戒毒綜合症”在30 min後全部消失。連續注射5 d後可完全戒除毒癮，且沒有副作用。1998年，加拿大國際韋克斯技術公司利用河魨毒素成功研製成一種名為tetrodin的戒毒新藥。利用河魨毒素來戒除毒癮，可謂“以毒攻毒”的一大創舉。 ^[94] 

限制河毒素成為藥物的最大問題在於有效劑量與有毒劑量十分接近，臨牀用藥方面的應用應以降低毒性為前提。因此如採用化學合成、修飾技術，對TTX進行改構，特異性地增強鎮痛作用而降低毒性，則能推動河毒素的商品化進程。 ^[95] 

河魨毒素是特異性強的Na⁺通道阻斷劑。當其位於膜外側與鈉離子通道受體部位Ⅰ結合，能阻止鈉離子進入細胞內，從而阻斷電壓依賴性鈉通道，影響細胞膜動作電位的產生和傳導，阻滯動作電位，抑制與之相關的生理活動。研究表明，河魨毒素對Na+通道的影響可能是其鎮痛的機制。 ^[96] 

中樞性鎮痛藥嗎啡對各種疼痛均有強大的抑制作用，但因對之容易產生耐受性和成癮性而不能廣泛和連續使用，而河魨毒素對多種鈍痛及鋭痛均有緩解作用，且不會對之產生依賴性，可減輕晚期癌症患者的疼痛。單獨使用河魨毒素也具有一定鎮痛作用，能夠抑制甲醛引起的炎症性疼痛和水腫；河魨毒素與茚蟲威聯合應用有協同鎮痛抗炎作用，在早期兩者聯合使用，其鎮痛強度與嗎啡相差不多，在晚期給藥作用極其顯著，鎮痛強度遠遠超過嗎啡；小劑量河魨毒素和阿司匹林聯合使用能明顯提高鎮痛療效。河魨毒素也具有很強的局部麻醉作用，其效力比常用局麻藥強千倍以上，持續時間也明顯延長；河魨毒素具有鎮痛作用，用醋酸刺激引起小鼠腹膜炎症而產生疼痛，表現為扭體反應。微量河魨毒素或者微量河魨毒素聯合小劑量的戊巴比妥鈉注射到小鼠體內後，小鼠扭體的頻率降低。河魨毒素對器官的缺血性損傷具有保護作用，可明顯降低腦梗死的體積及神經功能缺失的症狀。河魨毒素對常規心律失常具有較好的拮抗作用，特別是在抗室顫方面效果顯著。但是以上實驗均是在小鼠或兔子身上做的，還沒有應用到臨牀醫學上。動物實驗發現，河魨毒素對嗎啡戒斷反應具有明顯的抑制作用，可以用作阿片類毒品的戒毒藥物。加拿大科學家已經將其應用於臨牀，效果比較顯著。另外，河魨毒素在治療癌症、延緩衰老和提高免疫力等方面也取得了顯著的成效。 ^[97-100] 

臨牀上若使用河魨毒素劑量過大，會導致遠端神經受損，而神經損害可累及神經根、植物神經和中樞神經。因此，為了避免河魨毒素在臨牀應用中產生全身毒性反應，已研製出河魨毒素微膠囊，將其分散地移植到坐骨神經的細胞膜下，既能起到局部麻醉的作用，又能降低對神經系統的毒性。河魨毒素微膠囊的研發成功，可以使河魨毒素在臨牀上得到廣泛應用。河魨毒素與神經變性有關。用河魨毒素處理神經膠質細胞，導致692個細胞基因表達發生異常。因此，河魨毒素作為一種神經毒素，為研究基因的表達規律及神經衰退機制提供了一條新途徑。另外，河魨毒素還可治療與睡眠相關的疾病。在網狀腦橋嘴核和藍斑下核內微量注射河魨毒素，它們的活性受到抑制，導致快速眼動睡眠時間和非快速眼動睡眠時間減少，證明河魨毒素能降低腦橋區的活性，影響生物的睡眠—覺醒狀態。 ^[101] 

河魨魚營養豐富，味道鮮美，有長江第一鮮之稱。河魨魚的食用在中國、日本等亞洲國家有着悠久的歷史，並逐漸形成特有的河魨飲食文化。日本還將河魨宴視作國宴，招待貴賓。然而，即使對河魨烹調人員進行專業培訓，飯店得到衞生部門許可及實施特許經營，如加工處理不當，還會引起食物中毒及致殘致死事故，嚴重威脅人們的生命安全。統計在1972-1993年間，僅日本發生河魨中毒者就達1258人，致死279人之多。中國河魨中毒事件較多，最高為1993年，死亡147人。 ^[102-103] 

河豚毒素對熱穩定，於100℃處理24h或120℃處理20-60min方可使毒素完全破壞。中國古書曾記載“河豚出於江海，有大毒，能殺人。”明代黃省曾的《魚經》雲：“凡烹調者，腹之子、目之精、脊之血必盡棄之。”“凡洗宜極淨，煮宜極熟，治之不中度，不熟則毒於人。”這説明在烹調過程中河豚毒素是很難除去。因此：加強河豚魚知識宣傳，瞭解毒性，避免誤食或貪其美味但處理不當而中毒；對於某些毒性較小的河豚魚品種應在專門單位由有經驗的人進行加工處理之後製成罐頭或乾製品用於食用。 ^[37] 

由於河豚毒素在極低濃度即可阻塞Na⁺通道，使河豚魚中毒潛伏期縮短，絕大多數在食用後10~45 min發病，病情發展迅速，先是皮膚有麻或刺痛感，很快延及手指、四肢及其它部位，產生廣泛的肌肉麻痹；消化系統出現嘔吐、腹瀉，嚴重者可致呼吸肌麻痹、血壓下降、循環衰竭。國內外尚無特效解毒劑，一般採用綜合對症治療措施，如早期服用1%硫酸銅100 mL催吐；用1:5 000高錳酸鉀或0.2%活性炭懸浮液洗胃；靜脈注射高滲或等滲葡萄糖溶液，以促進毒素的儘快排泄；維持呼吸；解毒，莨菪類藥物包括阿托品、東莨菪鹼、山莨菪鹼、樟柳鹼等大劑量應用對救治河豚魚類中毒有顯著效果；肌肉麻痹者可肌注1%鹽酸士的寧2mL及維生素B2、B6去麻痹，咖啡因、山梗烷醇酮和硫代硫酸鈉與生理鹽水一起靜脈注射也有顯著療效。同時可採取補液等對症治療措施。 ^[104-105] 

自1990年《水產品衞生管理辦法》頒佈以來，中國的法律規定就禁止食用鮮河魨，這是基於生長在深海的劇毒河魨魚肌肉有毒而作出的防範規定。江蘇省地方標準DB32/T 543-2002“無公害家化暗紋東方魨安全加工操作規範”規定該品種的肌肉TTX含量不應超過10MU/g，而其餘部位包括卵巢、肝臟、脾、腎、血液、眼球、膽、胃、腸、心臟、腮均作為有毒廢棄物處理。 ^{[7]  [16]}