圖位克隆

圖位克隆(Map - based cloning) 又稱定位克隆(positional cloning) , 1986 年首先由劍橋大學的Alan coulson 提出[5 ] ,用該方法分離基因是根據目的基因在染色體上的位置進行的,無需預先知道基因的DNA 順序,也無需預先知道其表達產物的有關信息,但應有以下兩方面的基本情況:一是有一個根據目的基因的有無建立起來的遺傳分離羣體,如F2、DH、BC、RI 等。二是開展以下幾項工作:(1) 首先找到與目標基因緊密連鎖的分子標記;(2) 用遺傳作圖和物理作圖將目標基因定位在染色體的特定位置;(3) 構建含有大插入片段的基因組文庫(BAC 庫或YAC) ;(4) 以與目標基因連鎖的分子標記為探針篩選基因組文庫;(5) 用獲得陽性克隆構建目的基因區域的跨疊羣;(6) 通過染色體步行、登陸或跳躍獲得含有目標基因的大片段克隆;(7) 通過亞克隆獲得含有目的基因的小片段克隆;(8) 通過遺傳轉化和功能互補驗證最終確定目標基因的鹼基序列。

用該方法分離基因是根據功能基因在基因組中都有相對穩定的基因座，再利用分子標記技術對目的基因進行精確定位的基礎上，用與目的基因緊密連鎖的分子標記篩選DNA文庫，從而構建目的基因區域的物理圖譜，再利用此物理圖譜通過染色體步移逐步逼近目的基因或通過染色體登陸的方法，最終克隆目的基因並通過遺傳轉化實驗可以研究目的基因的功能。

1、建立目的基因的遺傳分離羣體

2、找到與目的基因緊密連鎖的分子標記

3、用遺傳圖或物理作圖將目的基因定位在染色體特定位置

4、構建含有大插入片段的基因組文庫

5、以與目的基因連鎖的分子標記為探針篩選基因組文庫

6、用陽性克隆構建目的基因區域的跨疊羣

7、通過染色體步移、登陸或跳查，獲得含有目標基因的大片段克隆

8、通過亞克隆獲得目標的小片段克隆

9、通過遺傳轉化和功能互補驗證，最終確定目標基因的鹼基序列。

1、需要有精確的遺傳圖譜

2、遺傳圖譜上離目的基因很近的分子標記在物理圖譜上還相距甚遠

3、高等植物基因組極其複雜，存在大量重複序列，在實際操作中會遇到走不動的難題。