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原位PCR
(在組織細胞裏進行PCR反應)
鎖定
目錄
原位PCR組織處理的要求
原位PCR應用範圍
主要應用於兩方面:(1)檢測外源性基因片段,提高檢出率,集中在病毒感染的檢查上,如HIV、HPV、HBV、CMV等;(2)觀察病原體在體內分佈規律(3)內源性基因片段,如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。(4)檢測導入基因;(5) 遺傳病基因檢測如β-地中海貧血。
原位PCR大致過程
實驗用的標本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脱落細胞、血細胞等。其基本方法為多聚甲醛固定組織或細胞,蛋白酶消化處理組織;在組織細胞片上滴加PCR反應液進行擴增,覆蓋並加液體石蠟後,在原位PCR儀上進行PCR循環擴增,PCR擴增結束後用標記的探針進行原位雜交,最後顯微鏡觀察結果。
原位PCR實驗玻片的處理
固定液的選擇標準是什麼?
保持組織結構,最大限度地保持細胞內DNA或RNA水平,使引物和探針更易於進入細胞內,在規定的時間內進行反應。
原位PCR組織固定液和固定時間
固 定 劑 固 定 時 間
細 胞 組 織
甲醇/丙酮(1:1) 4min 20min
4%多聚甲醛 30min 60min
2%戊二醛 30min 60min
10%中性福爾馬林 overnight overnight
原位PCR基本方法
②蛋白酶K消化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細胞片55℃消化處理2h後,96℃2min以滅活蛋白酶K。
⑤顯微鏡觀察結果。
待檢石蠟切片上的非特異性結合位點經過充分封閉,內源性DNA和RNA經核酶充分消化後,通過生物素化單抗與親和素系統的橋聯,將生物素化的DNA報告分子固定在石蠟切片上,進行原位PCR擴增,擴增產物經原位核酸雜交,以雜交信號指示待測抗原是否存在。
原位PCR與PCR的區別
PCR是提取細胞或組織中的DNA進行基因擴增反應,而原位PCR是保持細胞或組織的完整性,使PCR反應體系滲透到組織和細胞中,在細胞的靶DNA所在的位置上進行基因擴增,不但可以檢測到靶DNA,而且還可以瞭解靶DNA存在於何種細胞中,更有利於探討靶DNA與細胞之間的關係。
PCR所採用的反應體系能否應用於原位PCR
PCR與原位PCR所採用的反應體系中都包括Taq聚合酶緩衝液、Mg2+、K+、4×dNTP、一對特異性引物和Taq聚合酶。但是由於組織細胞間質會吸附Mg2+,所以原位PCR中採用的Mg2+濃度要比PCR的要高,採用4.5-5.5mM可以保證有足夠的Mg2+進行反應。另外由於原位PCR中的基因擴增過程中,各反應成分須經過滲透到靶DNA處才能進行擴增,所以建議將反應循環數增加到35 個。
原位PCR所需設備
原位PCR反應是在載玻片的平面上進行,保持水平可以使反應各組分均勻地分佈在組織切片上,所以須在原位PCR儀上進行,該儀器不但可以使載玻片保持水平,而且還可以給載玻片進行均勻地加熱,保證擴增反應的順利進行。
原位PCR探針種類
原位PCR探針標記物種類
常用標記物有地高辛半抗原(digaoxigenin),生物素(biotin),過氧化物酶(HRP),還可以標記一些熒光物質如異硫氰酸熒光素(FITC),花青(cyanine,Cy2,Cy3,Cy5)等。
原位PCR怎樣設定原位PCR對照實驗
設立陽性對照,即用已知陽性細胞或組織切片做陽性標誌,實驗結果應呈陽性,表明實驗方法準確可靠。同時要設立陰性對照,即用已知陰性細胞或組織切片作陰性對照,實驗結果應呈陰性,表示實驗方法無假陽性結果;也可以用實驗細胞或組織切片,不加標記的dUTP(直接法),PCR結果顯示陰性,或不加引物或不加TaqDNA聚合酶等,結果均應陰性。
原位PCR中直接法和間接法有何異同
直接法:進行原位PCR擴增以前,把同位素或非同位素(常用)標記的核苷(如dig-dUTP及Biotin-dUTP)標記的底物或引物5’末端連接標記物加入PCR反應液中,隨着擴增的進行,標記的核苷或引物直接摻入到PCR產物中,然後免疫組化直接進行檢測。間接法:先進行細胞內目的DNA基因原位擴增,然後用標記的探針進行核酸分子原位雜交以定位檢測擴增的DNA的技術,步驟相對較多,需時長,但結果可靠。
獲得特異原位PCR結果需要考慮哪些關鍵因素
原位PCR技術操作包括了組織學技術、PCR技術、原位雜交技術及免疫組化學技術,因此在複雜的操作過程中,有很多因素影響實驗結果。要考慮的一些關鍵因素有待檢組織的有效固定,在PCR前的組織預處理包括酶消化使核酸有效暴露,PCR環節中要設計特異的擴增引物、Mg2+的濃度、TaqDNA聚合酶用量、反應循環參數。間接法中用原位雜交檢測時考慮探針濃度、抗體濃度和顯色時間。
原位PCR中的組織預處理和原位雜交是否相同
要獲得理想的原位PCR結果,需要將待檢組織進行預處理使核酸充分暴露,這和原位雜交組織預處理的原則相同。因此原位雜交中的組織預處理步驟如HCL和蛋白酶處理等同樣適用於原位PCR。
原位PCR原位PCR的優勢和不足
PCR雖然能擴增包括福爾馬林固定、石蠟包埋組織的各種標本的DNA,但擴增的DNA或RNA產物不能在組織細胞中定位,因而不能直接與特定的組織細胞特徵相聯繫,這是該技術一個侷限性。原位雜交雖具有良好的定位能力,但由於其敏感性問題,尤其是在石蠟切片中,尚不能檢測出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR可使擴增的特定DNA片段在分離細胞和組織切片中定位,從而彌補了PCR和原位雜交的不足。
兩者實驗所需試劑沒有差別,但由於組織芯片的高通量特點,比起傳統的病理切片來説,所加的試劑量要遠遠低於病理切片,勞動強度也大大降低。
原位PCR配置
主機一台,個人存儲卡一張,原位PCR適配器
1.適用於96×0.2ml PCR管或77×0.5ml PCR管或8×12PCR板不需要更換模塊;
2.反應槽温控範圍:4-99℃;
3.控温精度:±0.2℃;
4.模塊均一性:≤±0.5℃;
5.温控速率:升3℃/秒,降2℃/秒,速率可調;
6.程序數目:儀器可存100個,配單獨的個人卡,卡上可存10個,方便插入其他同類機器上直接調用預設好的程序;
7.設有斷電自動重啓選項
8. RS-232接口和打印機接口
9. 編程模式:梯度功能、可調升降温速率、時間和温度增幅、孵育模式、原位模式、鏈接功能、暫停功能;
10. 帶熱蓋,熱蓋温度和高度可調,控温範圍:37-110℃;
11.尺寸(長x 寬x 高) cm:26 x 41 x 27
12.重量(kg):12.4
13.最大功率要求: 500 W
14.電源:所有型號均為230 V/50-60 Hz
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