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分子原位雜交

鎖定
分子原位雜交:利用一段順序的單鏈DNA或RNA作探針,與解鏈的染色體上的DNA單鏈進行原位雜交,確定DNA或RNA所在位置。
中文名
分子原位雜交
原    料
一段順序的單鏈DNA或RNA作探針
措    施
解鏈的染色體上DNA單鏈原位雜交
目    的
確定DNA或RNA所在位置

分子原位雜交引言

核酸原位雜交技術就是利用放射性或非放射性標記的已知核酸探針,通過放射自顯影或非放射檢測系統在組織、細胞及染色體上檢測特異DNA或RNA序列的一種技術,是一種直接、簡便的研究基因定位和表達的方法。 原位雜交的雜交雙方是待測核酸序列及探針,待測核酸序列可以是克隆的基因片段,也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。核酸探針是指用放射性同位素、非放射性熒光染料直接或間接標記的,能與特定的核酸序列發生特異性互補的已知DNA或RNA片段。根據其來源和性質可分為cDNA探針、基因組DNA探針、寡核苷酸探針RNA探針等。 原位雜交的基本原理 :當溶液中的DNA分子經高温或高PH處理後,DNA雙鏈分子會變性產生兩條單鏈,如果將温度逐漸下降或PH恢復到中性,單鏈會按照鹼基互補配對的原則,重新形成氫鍵恢復到原來的雙鏈結構。如果兩條單鏈的來源不同,只要它們之間的鹼基順序同源互補或者部分同源互補,在條件適宜時,就可以全部或部分復性,產生分子雜交。 原位雜交技術包括有:菌落原位雜交(colony in situ hybridization)、斑點雜交法(Dot blot)、Southern印跡雜交(Southern blot)、Northern印跡雜交(Northern blot)、組織原位雜交(Tissue in situ hybridization)和基因組原位雜交(Genome in situ hybridization) v原位雜交組織化學技術生命科學的研究中可視為一項革命性的技術。它使它們的研究從器官、組織和細胞水平走向分子水平。為各個學科的研究帶來突破性的進展。其中特別突出的是細胞或組織的基因表達、染色體分析、病毒診斷和發育生物學。 原位雜交技術主要步驟: 材料處理及細胞樣品的固定; 樣品的製備和預處理; 探針的製備和預雜交; 探針及樣品的變性; 雜交温育; 檢測雜交信號,進行結果分析。

分子原位雜交分子雜交作圖法

片段間重疊的信息來自於每個片段所含內容的部分信息。在解釋什麼是部分信息之前,必須強調的是,在這裏我們稱片段為克隆(clone)。在用不同的方式將每份目標DNA分子打碎並將片段克隆之後,我們就得到了幾千個克隆構成的集合,稱做克隆庫(clone library)。
每個克隆的部分信息是通過雜交實驗(hybridization experiment)來獲得的。在這些實驗裏,我們檢測被稱為探針(probe)的小序列可否與克隆結合或雜交,如果發生了結合,就説明該克隆包含與該探針序列互補的序列。對於同一個克隆,我們對採用不同的探針重複雜交實驗,與該克隆雜交的所有探針的集合稱為該克隆的指紋。指紋重疊的兩個克隆可能來自目標叫A分子的交疊區域。例如,如果我們知道了探針人x、y、z可能與克隆A結合,而探針x、w、和z能與克降B結合,我們就很有理由相信克隆A和B互相交疊,如圖1所示(除非存在重複片段)。注意,這類信息一般並不能足以使我們確定這些探針在目標DNA中的位置,而僅能確定它們的相對順序。
(圖1) (圖1)
在雜交實驗中各種錯誤都可能發生。首先,探針可能結合失敗,這就產生了假陰性(False negative)的結果;其次,探針也可能結合到了不該結合的位置上,產生假陽性(false positive)結果;有時還會出現人為對實驗結果的判讀錯誤,這也可能產生假陽性或假陰性結果。有時,甚至在雜交尚未發生前錯誤就已出現。在克隆過程中,DNA分子的兩個片段可能會發生融合並像單一克隆那樣進行復制,這種克隆稱之為嵌合克隆(chimeric clone).它可使人們產生關於探針相對順序的錯誤推斷;嵌合現象常有發生,故其已成為雜交作圖中的一個嚴重問題。有估計認為在許多克隆庫中有高達40%一60%的克隆實際上是嵌合體。克隆過程中的另一類錯誤是缺失(deletion),即克隆丟失了一個內部片段,因而使目標DNA分子中兩個本不相鄰的片段連接在一起.
另外還有兩種情況也可使雜交標圖過程出現問題。第一是探針不唯一,這意味着探針可與目標DNA分子一個以上的位點結合,這些位點序列稱為重複序列(repeat)。一種稱做序列標記位點(sequence tagged site, sts)的技術可避免這個問題,它產生的探針可與目標DNA分子上專一的位點進行雜交。第二個問題是數據缺乏,因為在雜交實驗中完成所有的雜交不太可行。分享技術(pooling technique)是解決此類問題的措施。