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亞細胞定位
鎖定
- 中文名
- 亞細胞定位
- 外文名
- subcellular localization
亞細胞定位生物信息學預測法
不同的細胞器往往具有不同的理化環境,它根據蛋白質的結構及表面理化特徵,選擇性容納蛋白。
蛋白質表面直接暴露於細胞器環境中,它由序列摺疊過程決定,而後者取決於氨基酸組成。因此可以通過氨基酸組成進行亞細胞定位的生物信息學預測。
亞細胞定位免疫熒光法
亞細胞定位直接法
將標記的特異性熒光抗體,直接加在抗原標本上,經一定的温度和時間的染色,用水洗去未參加反應的多餘熒光抗體,室温下乾燥後封片、鏡檢。
亞細胞定位間接法
如檢查未知抗原,先用已知未標記的特異抗體(第一抗體)與抗原標本進行反應,用水洗去未反應的抗體,再用標記的抗抗體(第二抗體)與抗原標本反應,使之形成抗體—抗原—抗體複合物,再用水洗去未反應的標記抗體,乾燥、封片後鏡檢。如果檢查未知抗體,則表明抗原標本是已知的,待檢血清為第一抗體,其它步驟的抗原檢查相同。
亞細胞定位GFP融合蛋白表達法
GFP是綠色熒光蛋白,在掃描共聚焦顯微鏡的激光照射下會發出綠色熒光,從而可以精確地定位蛋白質的位置。綠色螢光蛋白(GFP)是一個由約238個氨基酸組成的蛋白質,從藍光到紫外線都能使其激發,發出綠色熒光。通過基因工程技術,綠色螢光蛋白(GFP)基因能轉進不同物種的基因組,在後代中持續表達,並且能根據啓動子特異性地表達。
亞細胞定位應用實例
分別用70%乙醇和滅菌蒸餾水清洗金粉(直徑為1 μm),加入滅菌蒸餾水製成金粉懸浮液,取100 μL 放在含有1.0 cm2 洋葱表皮的玻璃皿中,邊振盪邊加入10 μL pCambia2301-GaMYB2-GFP質粒,逐步加入40 μL 0.1 mol·L-1 亞精胺和100 μL2.5 mol·L-1 CaCl2,振盪混勻。基因槍GDS-80轟擊時氦氣罐的氣壓為1 300 psi,取10 μL DNA 包裹好的微粒懸浮液加到基因槍中央,進行轟擊,之後放置25℃避光過夜培養,使用ConfocalLaser激光共聚焦顯微鏡觀察。