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OPN活性蛋白

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OPN (osteopontin,OPN活性蛋白)是一種高度糖基化和磷酸化的酸性蛋白,存在於人體多種組織和體液中,在母乳的含量甚高,且初乳中含量最高。OPN作為母乳關鍵活性營養髮揮重要活性功能,是母乳中重要的免疫活性蛋白。OPN的糖基化修飾以O-聚糖為主,其中唾液酸化比例高,因此也可稱為唾液酸糖蛋白。研究發現OPN在中國媽媽乳汁中的含量更是明顯高於有研究數據的其它國家,對嬰兒的腸道早期發育、免疫調節、減少發熱、促進大腦和認知發育等方面發揮關鍵作用。 [1] 
中文名
OPN活性蛋白
外文名
Osteopontin
主要功能
增強腸道保護屏障、實現全身免疫保護、減少50%發熱不適、促進認知發育等 [1] 
性質
高度糖基化和磷酸化的酸性蛋白

目錄

  1. 1 初乳關鍵免疫活性蛋白
  2. ▪ 母乳中重要的活性成分
  3. ▪ 母乳中含量豐富
  4. ▪ 嬰兒臍帶血及血漿中含量豐富
  5. 2 對嬰兒早期發育的作用
  1. ▪ 免疫保護
  2. ▪ OPN配方餵養兒細胞因子更接近母乳餵養兒
  3. ▪ 腸道健康保護
  4. ▪ 大腦髓鞘形成與認知發育
  5. 3 添加OPN的配方奶粉
  1. ▪ 人乳中OPN含量遠高於牛乳
  2. ▪ 人乳OPN和牛乳OPN主要功能結構相似
  3. ▪ 未強化OPN配方奶OPN含量低
  4. 4 生物學機制
  5. ▪ OPN的作用機制
  6. ▪ OPN在不同器官、系統中的作用
  1. 5 OPN活性蛋白的提取

OPN活性蛋白初乳關鍵免疫活性蛋白

OPN活性蛋白母乳中重要的活性成分

OPN是母乳中重要的活性物質，具有調節免疫、促進腸道發育等多種生物學意義，是嬰兒早期發育重要的營養支持。
母乳活性成分是指天然存在於母乳中的，具有生物學效應的成分，比如以免疫球蛋白、OPN活性蛋白、溶菌酶、脂肪球膜蛋白為代表的活性蛋白類，還包括細胞因子、生長因子寡聚糖、益生菌、OPO、gsMO、a-lac等成分。
母乳活性成分具有促進新生嬰兒組織器官發育成熟、調節免疫功能、促進生長髮育等多種功能,是母乳餵養促進母嬰健康的重要因素。嬰兒配方粉中添加母乳活性成分,可以模擬母乳的生物學作用,使配方奶的餵養效果更加接近母乳。 [1] 
OPN（OPN活性蛋白）是母乳活性成分中的重要成員，有促進腸道發育，增強腸道屏障保護功能，調節免疫，促進認知發育等作用。 [1] 

OPN活性蛋白母乳中含量豐富

OPN最初發現於骨骼中，隨後發現體內多種組織細胞均可合成與分泌。OPN廣泛分佈於包括骨骼、牙齒、腎、腦、肌肉、軟骨、膀胱在內的多種組織和巨噬細胞、自然殺傷細胞、血管平滑肌細胞中，在乳汁和血漿中也有發現，其中，乳汁，尤其是初乳中OPN的含量最高，隨着哺乳時間的延長，其濃度逐漸下降。
在對中國和日本哺乳媽媽乳汁OPN含量的研究中發現，隨着嬰兒周齡的增加，母乳中OPN的含量都表現出了逐漸下降的趨勢。
不同國家、不同個體母乳中OPN含量和在總蛋白中的比例均不同，其原因可能與基因、哺乳母親的飲食習慣和環境有關。2018年的研究發現，中國哺乳母親的乳汁中OPN含量（266.2mg/L），明顯高於韓國（216.2mg/L）、日本（185mg/L）和丹麥（99.7mg/L）。
中國哺乳母親的乳汁中OPN在總蛋白中的比例（2.7%），也高於韓國（1.8%）、日本（2.4%）和丹麥（1.3%）。 [1] 

OPN活性蛋白嬰兒臍帶血及血漿中含量豐富

OPN存在於大多數組織和體液中,研究人員不僅檢測了母乳、牛乳中OPN的濃度,還對臍帶血、3月齡嬰兒、孕婦和非孕婦成人的血漿樣本進行了檢測[9]。
檢測結果發現,3月齡嬰兒血漿和臍帶血血漿中的OPN濃度分別為342 ng / mL和263 ng / mL ,成人血漿中OPN的濃度為35 ng / mL[9]。
3月齡嬰兒血漿和臍帶血血漿中的OPN水平是成人的7至10倍。臍帶血和小嬰兒血漿中高濃度的OPN水平提示OPN對嬰兒生命早期的健康和生物學作用非常重要[9]。

OPN活性蛋白對嬰兒早期發育的作用

OPN活性蛋白免疫保護

OPN在免疫保護方面包含兩個方面
腸道免疫。OPN活性蛋白可直達腸道，幾乎不會被胃酸破壞，通過促進腸道發育的方式，增強腸道免疫，減少胃腸道疾病，比如壞死性小腸結腸炎，為生命早期提供免疫保護。[1]
全身免疫。OPN可以促進敗血症引起的急性肺損傷中的嗜中性粒細胞遷移;同時也被證明可以調節巨噬細胞功能，包括增殖、遷移、激活、吞噬，促進炎細胞因子產生和抑制一氧化氮合成；OPN還是樹突狀細胞的生存因子，可以促進其成熟和發揮作用。另外，OPN還可調節Th1和Th2的產生，促進T細胞遷移以及極化等方面起重要作用
OPN配方奶餵養兒發熱減少
一項隨機、對照研究發現，0-6月齡內OPN配方奶餵養兒發熱情況顯著更低，減少幅度可達50%。另外雖然呼吸道疾病和胃腸道疾病的發病率沒有區別，但OPN配方奶餵養兒（F65，F130組）的呼吸道和胃腸道問題少於不含OPN的普通配方奶餵養兒（F0組），可能是OPN組餵養兒發熱明顯少的因素。
另外，雖然沒有得出統計學意義，但根據父母的反饋，OPN配方奶餵養兒哭鬧和失眠的發生也比普通奶粉餵養兒更少。 [1] 

OPN活性蛋白OPN配方餵養兒細胞因子更接近母乳餵養兒

細胞因子是重要的生理信號分子,影響免疫系統發育。OPN對嬰兒免疫系統的影響還表現為顯著降低血漿促炎性細胞因子水平。
研究發現,添加OPN的嬰兒配方奶餵養兒細胞因子反應與母乳餵養兒更接近。與普通配方奶粉嬰兒相比,OPN配方奶嬰兒血清腫瘤壞死因子α水平顯著降低。另外,OPN配方餵養嬰兒的IL-12的濃度,比普通餵養組更接近母乳餵養組嬰兒的水平。 [1] 

OPN活性蛋白腸道健康保護

OPN大部分可以耐受消化酶、胃酸的分解，以完整的形式進入腸道被吸收，參與胃腸道發育的過程，對嬰兒腸道發育成熟、腸道免疫建立都有非常重要的意義。
母乳活性成分，OPN活性直達嬰兒腸道
對乳蛋白成分體外消化生物學試驗中發現，人乳OPN在通過pH值4.0甚至更高酸度的模擬胃液時，大部分OPN可以完整的通過，進入腸道，只有分子量為34和23 kDa的OPN片段會被胃蛋白酶輕微降解。
母乳中的OPN進入腸道後，完整或部分完整的OPN和OPN多肽可以與腸上皮細胞的多種整合素和CD44受體結合或直接被消化吸收，進入循環系統到達靶細胞後激活信號傳導通路，進而發揮多種作用。
OPN可以通過腸壁被吸收
生物素酰化的牛乳OPN（b-OPN）溶於飲用水，20μg/ml，給與野生型小鼠飲下，8天后在外周血中未檢測到b-OPN。
用灌胃的方式給與野生型小鼠20 μg/ml或200 μg/ml OPN，均在外周血中檢測到OPN，濃度分別為~145 和 ~1050 ng/ml，顯著高於飲用水口服給與OPN組的野生小鼠（ P＜0.001）。 [1] 
OPN通過多種途徑參與腸道發育
為評估b-OPN（牛乳OPN）對腸道發育的影響，研究者對新生恆河猴進行了研究。將新生恆河猴（16只）進行隨機分組：母乳餵養組（4只），配方奶粉餵養（FF，6只），添加了牛乳OPN的配方奶餵養組（b-OPN，6只），餵養3個月後提取空腸mRNA進行微陣列分析。
研究發現，母乳餵養和FF組之間差異表達1017個基因，母乳餵養和b-OPN組之間差異表達217個基因，FF和b-OPN組之間119個基因差異表達。近50％的探針組位於中間模塊中，該該探針組的平均表達，普通配方組（FF）低於母乳組（BF），OPN配方組（ b-OPN）介於兩者之間。
該模塊豐富了與細胞粘附和運動，細胞骨架重塑，無翼和整合位點信號以及神經元發育相關的基因。這些經典途徑主要集中在整合蛋白上，它們是OPN的受體。母乳餵養的猴子和FF猴子的腸道轉錄組不同，但是與人乳相似水平的牛OPN會改變基因表達譜。從這個方面上，b-OPN組的猴子與母乳餵養的猴子更加相似。 [1] 
OPN減少胃腸道疾病
為研究OPN對胃腸道的作用，研究者用鼠進行模擬胃腸疾病的實驗。將實驗小鼠分為4組：對照組（不處理），實驗組1（DSS處理，對照），實驗組2（DSS處理+重組OPNμg/ml），實驗組3（DSS+乳汁OPNμg/ml）。DSS處理是指給予葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶於無菌蒸餾水7天，誘導實驗性結腸炎。
研究發現，與未給與OPN的DSS組比較，給與乳汁OPN組可以顯著減少結腸炎臨牀症狀（p＜0.05）。與給與重組OPN（r-OPN）比較，給與乳汁OPN組可以顯著減少結腸炎臨牀症狀（p＜0.05）。表現為，給與乳汁OPN組的小鼠體重下降減少、結腸縮短和脾臟腫脹降低，疾病活動指數降低，改善紅細胞計數並降低腸道中中性粒細胞活性，促炎介質的水平降低。
這項研究表明，在飲用水中施用生理濃度的牛奶OPN可以改善DSS誘發的急性結腸炎的破壞性宿主反應。 [1] 
OPN降低壞死性小腸結腸炎的嚴重程度
研究人員通過實驗對早產仔豬進行了研究。將26只早產仔豬隨機分為兩組，均進行2天的場外營養（PN）和1.5天的腸飼期，對照組：不含OPN配方；OPN組：在PN期間每隔三小時給與含OPN（2g/l）的去離子水5 ml/kg，在腸飼期間給與富含OPN（2.2 g/l）的配方奶。
研究結果顯示，OPN配方奶顯著降低早產仔豬NEC嚴重程度（P＜0·01），並且有降低NEC發生率的趨勢。 [1] 

OPN活性蛋白大腦髓鞘形成與認知發育

OPN在人乳中含量很高，除了對嬰兒腸道發育、免疫調節、細胞增殖和分化有重要的生物學效應外，OPN還與認知發育有關。從研究來看，OPN可以通過促進神經細胞髓鞘化促進神經系統發育。
在Rulan Jiang等人的動物實驗研究中，OPN陽性組（餵養含高濃度OPN正常母乳的野生型鼠仔）產後6天和8天時大腦OPN水平顯著高於OPN陰性組（餵養不含OPN母乳的OPN敲除鼠仔）。此外，OPN陽性組小鼠髓鞘鹼性蛋白和髓磷脂相關糖蛋白的表達水平更高，通過避暗實驗和疲勞轉棒實驗顯示，OPN陽性組小鼠的學習能力更強。
髓鞘是包裹在神經細胞軸突外面的一層膜，即髓鞘由施旺細胞和髓鞘細胞膜組成。髓鞘化使神經興奮在沿神經纖維傳導時速度加快，並保證其定向傳導，是新生兒神經系統發展必不可少的過程，也是神經系統發育的重要標誌。
OPN促進認知發育的機制為促進髓鞘的形成，OPN可以通過上調大腦中OPN水平促進髓鞘形成而可能在早期大腦發育中發揮重要作用。 [1] 

OPN活性蛋白添加OPN的配方奶粉

因為人乳和牛乳中OPN含量的巨大差異（OPN在母乳中含量可高達138mg/L，明顯高於牛乳和配方奶粉中的OPN含量18mg/L），未添加OPN的嬰兒奶粉中OPN含量非常少。添加OPN的嬰兒配方奶與未添加了OPN的配方奶相比在嬰兒免疫、減少發熱等方面的表現更接近母乳餵養兒。 [1] 

OPN活性蛋白人乳中OPN含量遠高於牛乳

牛乳與人乳中的OPN含量差別很大，不同媽媽乳汁中OPN的含量差別也非常大。
不同國家、個體人乳中OPN的含量差別雖然非常大，但人乳OPN平均濃度（138mg/L）明顯高於牛乳OPN含量（平均18mg/L）。所測OPN包含了完整的OPN（＞80%）和裂解的OPN的天然混合物。
在丹麥的一項研究中，檢測了29名丹麥女性乳汁中的OPN濃度，檢測結果發現，不同女性乳汁OPN濃度相差非常大，OPN濃度範圍在18-322mg/L，平均濃度為138 mg/L ，約佔乳汁中總蛋白含量的2.1%，遠高於牛乳中的OPN濃度18 mg/L。

OPN活性蛋白人乳OPN和牛乳OPN主要功能結構相似

OPN是含有特殊結構序列穀氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）的高度磷酸化的糖蛋白，OPN的糖基化修飾以O-聚糖為主，其中唾液酸化比例高，因此也可稱為唾液酸糖蛋白[4]。人OPN約含314個氨基酸殘基，分子量約44kDa，大小取決於其翻譯後的修飾程度（磷酸化和糖基化）[1]。來源於小鼠、大鼠、牛、豬、兔和雞的OPN,分別含294個氨基酸（aa）、318aa、278aa、303aa、311aa和264aa,aa同源性為35%～86%。
人乳和牛乳中的OPN主要功能結構相似。人乳OPN 包含有298氨基酸，牛乳OPN 是262個氨基酸，其中182個氨基酸相同，另外44個殘基結構具有高度相似性，約90%氨基酸序列高度相似。
人乳OPN磷酸化程度僅略高於牛乳（36 vs 28），約25個磷酸化位點和3個O-糖基化位點相同，有相同RGD序列以及水解位點。 [1] 

OPN活性蛋白未強化OPN配方奶OPN含量低

OPN在母乳中含量明顯高於牛乳和配方奶粉中的OPN含量（牛乳：18mg/L；母乳：138 mg/L），未強化OPN的嬰兒配方奶中，OPN含量很低 [9]，有必要強化配方奶中的OPN含量，使其更接近母乳。嬰兒配方食品中補充OPN可以有更多的健康益處[6]，且外源性補充OPN可以增加血漿中的內源性OPN的產生，促使其進一步發揮有益作用。
研究人員為了解普通奶粉餵養兒與OPN強化奶粉餵養兒之間的差別，進行了一項隨機臨牀試驗。
在這項研究中，研究人員招募了已經決定不進行母乳餵養的1-6月齡健康足月嬰兒240名（120名男孩，120名女孩），另外還招募了決定純母乳餵養的健康足月兒80名（40名男孩，40名女孩）。
研究人員將入組的嬰兒一共分為四組：純母乳餵養組（BF），不含OPN的普通奶粉餵養組（F0），含有牛乳OPN 65 mg/L的配方組（F65）和含有牛乳OPN 130 mg/L的配方組（F130）。
從入組開始給嬰兒餵養所在組的配方粉，在研究對象1月齡，4月齡，6月齡時分別採集血液標本，分析嬰兒血液學，血清細胞因子等情況，研究結果如下： [1] 
富含OPN的嬰兒配方奶可改善氨基酸代謝
研究發現，含OPN 130 mg/L的配方奶餵養兒（F130組），血漿蘇氨酸濃度顯著低於普通配方奶餵養兒（F0組）和含OPN 65 mg/L的配方奶餵養兒（F65組）；F130組嬰兒血漿纈氨酸，支鏈氨基酸（BCAAs）濃度顯著低於F0組，F130組嬰兒血漿氨基酸水平與母乳餵養組更接近。提示富含OPN的嬰兒配方奶可改善氨基酸代謝。
富含OPN的嬰兒配方奶減少嬰兒發熱
研究發現，在配方奶餵養組中，不含OPN的普通配方（F0組）組的發熱天數和發燒率明顯高於OPN餵養組（F65，F130），但F65組和F130組之間沒有顯著差異。
F65組和F130組在胃腸道疾病和呼吸道疾病發病率上沒有顯著差異，但F130組的患病率是低於F0組的，表明OPN下調了炎性細胞因子TNF-α水平，從而影響了免疫功能。 [1] 
富含OPN的嬰兒配方奶降低血漿促炎性細胞因子水平
研究發現，添加OPN的嬰兒配方奶餵養兒細胞因子反應與母乳餵養兒更接近。與普通配方奶粉嬰兒F0組相比，F65，F130組嬰兒血清腫瘤壞死因子α水平顯著降低，從而減少促炎信號，減少發熱和促炎性免疫應答。
BF組嬰兒中IL-12的濃度比F0高32％，而F65組和F130組嬰兒的IL-12的濃度在BF和F0之間。IL-12由活化的抗原呈遞細胞（樹突狀細胞，巨噬細胞）產生，它促進TH1反應的發展，是T細胞和NK細胞產生IFNg（干擾素）的有力誘導劑，IL-12在宿主防禦中至關重要，尤其在針對細胞內細菌感染的防護中。 [1] 
富含OPN的嬰兒配方奶增加外周T細胞和單核細胞比例
研究發現，母乳餵養會影響免疫細胞的組成和個體發育，而配方奶中添加生物活性OPN可能會增加T細胞和單核細胞的比例，而且，這種作用似乎是劑量依賴性的。
含OPN 130 mg/L的配方奶餵養兒（F130組），外周血T細胞比例顯著高於標準配方奶餵養兒（F0組）和含OPN 65 mg/L的配方奶餵養兒（F65組）。 [1] 
富含OPN的嬰兒配方奶安全性良好
與普通配方組嬰兒比較，OPN配方組嬰兒（F65，F130）在配方奶攝入量，身長、體重、頭圍Z評分，嬰兒睡眠狀況、不良反應方面沒有差異性，安全性良好。
純母乳餵養組嬰兒較配方奶餵養組（F0，F65，F130）嬰兒體重較高、頭圍較大，睡眠較少。
綜合以上結果，嬰兒奶粉中添加OPN具有良好的耐受性，嬰兒生長髮育正常，在嬰兒配方奶粉中添加OPN，使其濃度為人乳相似或為人乳粉的一半，可以減少發燒（疾病）和促炎性免疫應答（細胞因子分佈），提升寶寶的全身免疫力，使其更接近母乳的餵養效果。 [1] 

OPN活性蛋白生物學機制

OPN活性蛋白OPN的作用機制

OPN活性蛋白是高度磷酸化的糖蛋白，人體OPN約含314個氨基酸殘基，分子量約44kDa，大小取決於其翻譯後的修飾程度（磷酸化和糖基化）。磷酸化參與翻譯後修飾，對OPN生物活性發揮重要作用，如抑制血管鈣化，結合OPN受體（ αvβ3整合素）等。高度磷酸化使OPN帶大量負電荷，易於與帶正電荷的乳鐵蛋白形成複合物。人乳OPN的5個糖基化位點在細胞粘附活性中發揮重要作用。OPN在Th1型免疫反應中發揮關鍵作用，人乳OPN通過提高Th1反應，增強抵抗力。 [1] 
OPN作為一種細胞因子，可與多種物質結合，通過激活細胞內特異性信號傳導系統而介導細胞粘附、遷移和增殖等，發揮細胞信號分子作用。其作用機制包括以下幾個方面：
（1）多種整合素受體。αvβ1 、αvβ3 、αvβ5 、α5β1 、α8β1 、α4β1和α9β1 等多種整合素能與OPN 結合。2 個α4β1 整合素結合部位位於OPN 的N-末端凝血酶片酸的38 aa結構域上,α9β1 能結合凝血酶斷裂的OPN N-末端上新型識別序列SVVYGLR。
（2）細胞表面黏附性糖蛋白CD44。CD44變異體（CD44v ）以非RGD序列結合OPN 的C 末端和N 末端結構域，在瓣膜間質細胞中，OPN與CD44v6結合，可通過磷酸化AKT介導鈣沉積。
（3）補體H因子。OPN 能以高親和力結合H 因子, 調節補體活性。
（4）胰島素樣生長因子結合蛋白-5（IGFBP-5）。OPN可以與胰島素樣生長因子結合蛋白-5(IGFBP-5)結合。
（5）其它機制。羥基磷灰石(HA)、纖連蛋白(FN)、Ⅰ型膠原和骨鈣蛋白都能與OPN結合。非磷酸化OPN(np69)能與可溶性FN 形成免疫複合物, 而磷酸化OPN(pp69)能結合細胞表面相關的FN。 [1] 

OPN活性蛋白OPN在不同器官、系統中的作用

OPN參與機體多種生理和病例過程。在正常組織中，OPN主要在骨和上皮細胞表面表達; 在病理過程中，OPN在損傷和發炎的上皮細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞和某些腫瘤細胞、涉及炎症浸潤的T細胞和巨噬細胞內高度表達,參與血管生成，炎症，細胞凋亡，傷口癒合，腫瘤轉移等。
（1）OPN與骨。OPN是成骨細胞的表型之一，在骨基質的礦化和吸收過程中起重要作用。
（2）OPN與心血管系統。OPN 是血管平滑肌由收縮表型向合成表型轉化的標誌基因，與動脈粥樣硬化斑塊的鈣化密切相關，在心血管特別是血管重塑過程中起重要調節作用。
（3）OPN與腫瘤。OPN參與細胞的炎症反應，促進細胞遷移、粘附及相關信號轉導，調節與腫瘤發生、發展相關基因的表達，促進細胞外基質的降解，抑制機體對腫瘤的免疫作用，加速腫瘤的進展。
（4）OPN與免疫系統。OPN 被描述為早期 T 細胞活化基因 1(Eta-1),在對抗感染的非特異性免疫及自身免疫中起一定作用,對巨噬細胞有化學誘導的作用等。
（5）OPN與消化系統。有OPN 分佈與表達的消化器官和組織有：胃，小腸，闌尾，大腸，膽囊 上皮，肝內膽管，胰腺，唾液腺管和唾液腺黏液細胞。 膽囊中OPN 可能與粘蛋白類 似的特性與結石的形成有關。
（6）OPN與泌尿系統。腎小管細胞和腎乳頭表面細胞均可分泌OPN，正常人尿中OPN的濃度為 6×10-8mol/L，足以抑制草酸鈣結晶，其在尿中濃度可以反映尿抑制結石形成的能力。 [1] 

OPN活性蛋白OPN活性蛋白的提取

食品中所添加的OPN來自於新鮮牛乳，經過一系列的分離、純化技術，包括離子交換層析（DE—AE—Sephacel）、疏水層析（Phenyl—Sepharose層析），再經濃縮、冷凍乾燥後，提取出OPN凍乾粉。根據所用奶源中OPN含量不同，採用儀器設備和提取純度不同，有報道從2L原料奶中可以提前大約19mgOPN凍乾粉，也有報道稱從1L原料奶中可以提取大約11mg的OPN，按照這樣的提取量來計算，約90噸牛乳中才能提取1公斤的OPN，非常珍貴。根據兩者在牛乳中的含量對比，提取同等重量OPN所需牛乳量是乳鐵蛋白的5倍。 [1] 
參考資料