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DNA限制性內切酶酶切
鎖定
DNA限制性內切酶酶切是一項基於DNA限制性內切酶的基因工程技術,其基本原理是利用限制性內切酶對DNA上特定序列的識別,來確定切割位點並實現切割,從而獲得所需的特定序列。
- 中文名
- DNA限制性內切酶酶切
- 類 別
- 基因工程技術
- 基本原理
- 利用限制性內切酶識別
- 基 於
- DNA限制性內切酶
DNA限制性內切酶酶切相關介紹
生物體內能識別並切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。它是可以將外來的DNA切斷的酶,即能夠限制異源DNA的侵入並使之失去活力,但對自己的DNA卻無損害作用,這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。由於這種切割作用是在DNA分子內部進行的,故名限制性內切酶(簡稱限制酶)。
DNA限制性內切酶酶切酶切原理
限制性內切酶能特異地結合於一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上,並切割雙鏈DNA。它可分為三類:
Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴於ATP的存在。Ⅰ類酶結合於識別位點並隨機的切割識別位點不遠處的DNA,而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子,然後從底物上解離。
Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用,它們是重組DNA的基礎。絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的迴文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少數酶識別更長的序列或簡併序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位點在對稱軸一側,產生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端,如EcoRⅠ切割識別序列後產生兩個互補的粘性末端。
示意圖:
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'
3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
DNA限制性內切酶酶切影響因素
DNA限制性內切酶酶切影響條件
DNA限制性內切酶酶切處理方法
當微量的污染物進入限制性內切酶貯存液中時,會影響其進一步使用,因此在吸取限制性內切酶時,每次都要用新的吸管頭。如果採用兩種限制性內切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。
若兩者可用同一緩衝液,則可同時水解。
若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內切酶必須首先使用,隨後調節鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內切酶水解。也可在第一個酶切反應完成後,用等體積酚/氯仿抽提,加0.1倍體積3mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇,混勻後置-70℃低温冰箱30分鐘,離心、乾燥並重新溶於緩衝液後進行第二個酶切反應。
DNA限制性內切酶酶切酶切圖譜
DNA限制性內切酶酶切圖譜介紹
DNA限制性內切酶酶切圖譜,又稱DNA的物理圖譜,它由一系列位置確定的多種限制性內切酶酶切位點組成,以直線或環狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪製、DNA的無性繁殖、基因文庫的構建等工作中,建立限制性內切酶圖譜都是不可缺少的環節,近年來發展起來的RFLP(限制性片段長度多態性)技術更是建立在它的基礎上。
DNA限制性內切酶酶切構建方法
構建DNA限制性內切酶圖譜有許多方法。通常結合使用多種限制性內切酶,通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點及其相對位置。酶切圖譜的使用價值依賴於它的準確性和精確程度。