體外轉錄

轉錄模板必須滿足：

1. 在基因組全長克隆過程中，在正向引物5‘末端添加T7啓動子序列；

2. 以T7啓動子作為體外轉錄啓動子，在啓動子後面靶位序列連續帶有3個G,轉錄效率最 高；

3. 在正向引物5/端添加一個帽子G,有利於提高體外轉錄RNA分子的侵染活性。

1. 提取cDNA質粒；

2. 線性化質粒：（利用單一的酶切位點線性化有利於轉錄）

3. 純化質粒：（儘量避免RNase污染） ① 加等體積的Tris-苯酚：氯仿（1:1）到100μL限制內切酶消化體系，渦旋振盪20s, 13000g離心5min; ②上清轉移，加入2倍體積無水乙醇和1/10體積的3M的醋酸鈉（pH5.2），-20℃放置不少於2h或過夜放置; ③DNA質粒13000g離心5min ,並且用20μL H2O重懸，放於-20℃。

4. 體外轉錄：（根據以下組成配製反應液，輕輕混勻）

10*basal reaction buffer

2μL 5*accelerator solution

4μL 25mM rNTPs mixture

4.5μL RNase Inhibitor

0.5μL Template DNA

100ng-1μg Thermo T7 RNA polymerase

1μL Nuclease-free water

up to 20μL Total volume 20μL

5. 在37℃-42℃下放置2小時。

6. 轉錄產物可通過1%非變性瓊脂糖來檢測：取產物1μL,160V電壓，結果應為兩條帶， 上為DNA模板，下為RNA 產物。

注意： 1. 模板DNA（環狀或線型）：必須具有T7啓動子位點。同時，模板應為RNase-free級。在 質粒提取過程中如使用了RNase,必須通過苯酚·氯仿處理等方法除去RNase。