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雙縮脲法
鎖定
雙縮脲法名詞解釋
雙縮脲反應產生的紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測定蛋白質含量。
雙縮脲法方法介紹
雙縮脲法實驗原理
雙縮脲(NH2CONHCONH2)是兩個分子脲經180℃左右加熱,放出一個分子氨後得到的產物。在強鹼性溶液中,雙縮脲與二價銅離子形成紫色絡合物,稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵,或能夠以一箇中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應。
此法的優點是較快速 ,不同的蛋白質產生顏色的深淺相近,以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差,不適合微量蛋白的測定。
雙縮脲法試劑與器材
- 1. 試劑:
(1)標準蛋白質溶液:用標準的結晶牛血清清蛋白(BSA)或標準酪蛋白,配製成10mg/ml的標準蛋白溶液,可用BSA濃度1mg/ml的A280為0.66來校正其純度。如有需要,標準蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,計算出其純度,再根據其純度,稱量配製成標準蛋白質溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配製,酪蛋白用0.05N NaOH配製。
(2)雙縮脲試劑:稱以1.50克硫酸銅(CuSO4·5H2O)和6.0克酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O),用500毫升水溶解,在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀釋到1升,貯存於塑料瓶中(或內壁塗以石蠟的瓶中)。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉澱出現,則需要重新配製。
- 2. 器材:
雙縮脲法操作方法
2、樣品的測定:取2~3個試管,用上述同樣的方法,測定未知樣品的蛋白質濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。