羅光湘

2007年6月27日下午3點，美國肯塔基大學羅光湘教授從田勇泉副校長手中接過授聘證書，正式受聘任為中南大學客座教授。受聘儀式由校人事處處長陶立堅教授主持，副校長田勇泉教授，湘雅醫院副院長楊連粵教授等出席了大會。

會上，楊連粵教授介紹了羅光湘教授基本情況。田勇泉副校長髮表了重要講話，對羅光湘教授的到來表示熱烈的歡迎。他説：“羅光湘教授是我校校友，如今是美國肯塔基大學分子病毒與免疫學研究室主任，是一位出色的科學家。他在分子病毒與免疫學等研究領域內取得了舉世矚目的成就，在全世界也享有很高的榮譽。羅教授加盟我校，將為促進和帶動我校感染病學與微生物學等學科的發展發揮重的作用”。隨後，田副校長親自為羅教授頒發了客座教授聘書，併為他佩戴中南大學校徽。

會上，羅教授現場作了題為《ApoE與丙型肝炎病毒研究進展》的精彩報告。就丙型肝炎病毒的研究現狀、發展前景及現存的難題向與會專家老師作了深入探討，同時也把新的理論技術方法介紹給大家，受到了專家老師們的熱烈歡迎。

羅光湘教授主要從事丙型肝炎病毒和其他引起人類重要傳染性疾病的病毒分子生物學, 致病機理及抗病毒藥物的研究。

丙型肝炎是上世紀70年代中期通過排除甲型和乙型病毒性肝炎後而被發現的一種新型肝炎，當時被命名為輸血後非甲非乙型（NANB）肝炎。其病原體直一到1989年才通過分子克隆技術被發現，也是至今唯一在未分離到病原體之前通過分子克隆技術發現的人類病毒。丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染最顯著的臨牀特徵就是引起慢性感染，即大多數（高達85%）感染者轉為慢性病毒攜帶者，並有可能最終演變成肝硬化及原發性肝細胞癌。全世界約有1億7000萬人攜帶HCV，包括超過1000萬的中國感染者。如今，長效干擾素和利巴韋林聯合應用是治療丙型肝炎的最佳選擇，但其療效仍欠理想，加之不良反應及費用昂貴。所以研發更為安全有效的抗丙型肝炎病毒藥物及疫苗便迫在眉睫。HCV是一種有包膜的小核糖核酸（RNA）病毒，含有一條長約9600個核苷酸的單股正鏈RNA分子。病毒基因組包括5'端非翻譯區（340～341個核苷酸），一個編碼3010～3040個氨基酸多肽的開放讀碼框（open reading frame，ORF）和長度可變的3’端非翻譯區（圖1）。HCV基因組的特徵與黃病毒科中的黃病毒屬和瘟病毒屬十分相似，因此，HCV被納入黃病毒科，並被單獨分為HCV屬。HCV基因組的5’和3’端非翻譯區的核苷酸序列高度保守，含有順式作用元件，主要負責調控病毒蛋白的翻譯及病毒基因組的複製。相反，HCV基因組的ORF序列在不同的病毒株中高度變異。根據核苷酸序列的變異程度，HCV被進一步分為6個主要基因型和多個亞型。

HCV蛋白首先被翻譯成一條蛋白多肽，然後經細胞和病毒蛋白酶切割而成10個不同的病毒結構和非結構蛋白，其依次為C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。另外一種由核心蛋白編碼區經核糖體移碼翻譯而成的新蛋白，被命名為F或ARFP蛋白，其生物學特性和功能仍不清楚。在HCV感染者體內可檢測到抗F蛋白抗體，説明F/ARFP蛋白也許與HCV複製或致病性有關。HCV結構蛋白包括核心蛋白（C）、包膜蛋白E1和E2。至於p7是否存在於病毒顆粒中仍不清楚。C、E1和E2同時在細胞內表達後可以產生病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP），不過，這種重組的病毒樣顆粒並不具備感染性病毒的生物學活性。核心蛋白是由蛋白多肽的氨基端經細胞內的信號肽酶切割而成，具有多種不同的生物學活性，其主要功能是形成病毒的核衣殼。另外，C蛋白可與宿主細胞膜、核酸（RNA或DNA）及多種細胞蛋白質結合從而影響細胞正常信號的傳遞和功能，這有可能與丙型肝炎臨牀疾病的進展有關。已經證明C蛋白可影響脂質代謝，導致轉基因小鼠肝脂肪變及肝細胞肝癌。E1和E2均為糖蛋白，二者通過非共價鍵結合形成異二聚體，主要介導病毒的吸附和細胞進入。E2與細胞表面的HCV受體或輔助受體結合，E1則可能在病毒與細胞膜融合後參與病毒的脱衣殼過程。除了介導病毒吸附外，非糖基化的E2還具有抑制干擾素（interferon，IFN）誘導的雙鏈RNA激活蛋白酶（PKR）的功能，而PKR是介導IFN誘導的細胞內抗病毒防禦的一種主要蛋白。因此，HCV有可能通過E2抑制PKR來抵抗細胞內的抗病毒防禦功能。p7是一個大約7 KDa的疏水性小蛋白，在細胞內可能以六聚體形式存在，具有離子通道活性。金剛烷胺和多種長烷基鏈氨基糖衍生物可以抑制P7的離子通道，其他的p7抑制劑也已被發現並處於臨牀前研究階段。另外，p7對於病毒顆粒的裝配必不可少，但其具體的作用機理仍未闡明。HCV非結構蛋白包括NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，它們在病毒細胞感染週期中主要負責病毒蛋白質的切割和RNA的複製。此外，非結構蛋白可以抑制宿主細胞內的抗病毒防禦功能以及宿主的免疫應答，還可能直接參與感染性病毒顆粒的裝配和釋放。NS2（23 kDa）是一種疏水性的Ⅲ型跨膜蛋白，是NS2/3蛋白酶的主要成分，其功能是負責在NS2與NS3蛋白之間的順式切割。儘管NS2不直接參與RNA的複製，但對於病毒顆粒的裝配和釋放具有不可或缺的功能。另外，NS2也可能通過干擾細胞的正常功能而與病毒的致病性有關。NS3（70 kDa）具有多種酶活性，其氨基端的1/3是NS2/3蛋白酶的重要組成部分，同時作為絲氨酸蛋白酶，在輔助因子NS4A的協助下，負責病毒蛋白多肽NS3下游區域所有蛋白的切割（圖1）。NS3羧基端2/3段具有解繩酶和核苷三磷酸酶的活性，對於HCV RNA的複製極為重要。NS3蛋白酶和解繩酶/核苷三磷酸酶的原子結構已被確定，為研發NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑起到了十分重要的促進作用，如今，多種NS3蛋白酶的抑制劑已處於臨牀前或臨牀研究中，估計不久將會被用於丙型肝炎的臨牀治療。NS3還可能與HCV的慢性感染有關，已知NS3/4A絲氨酸蛋白酶能切割線粒體抗病毒信號傳遞蛋白（MAVS），從而阻斷視黃酸誘導基因-I（RIG-I）介導的干擾素調節因子3（IRF-3）的磷酸化以及病毒感染誘導的I型干擾素的產生。因此，HCV可能通過NS3/4A蛋白酶活性阻斷RIG-I和IRF-3介導的細胞抗病毒反應而得以在細胞內複製。NS3還與多種細胞蛋白質結合，但其在病毒複製和致病中的作用仍尚待闡明。NS4A是NS3絲氨酸蛋白酶的輔助因子，同時可協助病毒RNA複製體的膜附着。NS4B（27 kDa）為一種疏水的跨膜蛋白，是結合在膜上的HCV複製複合體的重要組成部分，但其在HCV複製中的具體功能尚不清楚。NS4B含有一個三磷酸鳥苷（GTP）結合位點，並且具有鳥苷三磷酸酶（GTP酶）活性。已經證明其GTP酶活性對於HCV RNA的複製非常重要。NS5A是一種磷酸化蛋白，主要以分子量56 kDa和58 kDa形式存在，NS5A可分為3個結構和功能特異的區域（Ⅰ，Ⅱ，和Ⅲ）。區域Ⅰ的原子結構已被確定，並揭示兩個相同的NS5A分子通過氨基端的相互結合而形成一個二聚體。區域Ⅰ和Ⅱ在病毒RNA的複製中起着十分重要的作用，而區域Ⅲ對於病毒顆粒的裝配極為關鍵。NS5A氨基端雙親性螺旋結構區鑲嵌於細胞內的雙層脂質膜上，其雙親性螺旋結構的破環可降低或阻斷HCV RNA的複製，説明膜結合的NS5A對病毒基因組的複製至關重要。此外，NS5A還能與一種細胞內的膜相關蛋白hVAP-A（B）結合，已經證明hVAP-A（B）在HCV RNA複製中起着非常重要的作用，但其具體作用機制仍有待進一步闡明。NS5A還參與細胞凋亡的調控，細胞的生長增殖以及細胞內信號傳遞。類似於遊離型E2，NS5A與PKR的相互結合同樣可拮抗干擾素誘導的細胞內抗病毒反應。與核心蛋白一樣，NS5A能干擾細胞內脂質及脂蛋白的新陳代謝。因此，NS5A不但與病毒 RNA的複製有關，而且通過影響正常細胞的代謝功能和拮抗細胞內的抗病毒機制而導致HCV的慢性感染。NS5B（65 kDa）為RNA依賴的RNA多聚酶（RdRp），它含有所有已知RNA聚合酶的基本結構。NS5B羧基端的21個氨基酸為高度疏水區，具有內質網膜附着的功能，儘管這段區域的刪除並不影響其體外RdRp的活性，卻可導致HCV RNA在細胞內複製的終止。NS5B也是磷酸化蛋白，不過，該蛋白的磷酸化對於RdRp活性及HCV RNA複製的作用仍不太清楚。NS5B的晶體結構已被解析，它的手指、手掌及拇指結構子域與其他聚合酶的典型結構類似，所不同的是其手指及拇指結構子域存在廣泛的相互結合。另外，除了在RdRp酶活化中心的NTP結合位點外，在離活性中心約30?處的酶表面還含有一個低親和性的GTP特異性結合位點，GTP特異性結合位點對於體外RdRp活性並不重要，但對於細胞內HCV RNA的複製卻非常關鍵。NS5B可與NS3蛋白酶結合而增強NS3解繩酶的活性。NS5B與許多細胞蛋白質結合而催化RNA的複製及參與病毒的致病過程。細胞親環蛋白（Cyclospphilin A）與N5SB結合來調控HCV RNA 的複製，親環蛋白抑制劑環孢菌素A及其衍生物可阻斷HCV RNA的複製，已進入治療丙型肝炎的臨牀試驗階段。HCV前體蛋白的特性及在HCV複製和致病中的作用所知甚少。儘管前體蛋白4AB、4AB5A及4B5A能夠在HCV亞基因複製子轉染的人肝癌細胞中檢測到，但對這些前體蛋白在HCV感染過程中的生物學作用卻不清楚。細胞表達的NS4AB能夠抑制內質網至高爾基體的物質運輸，而單獨表達4A、4B或同時表達4A和4B卻沒有這種作用，説明NS4AB前體蛋白很可能通過干擾宿主細胞蛋白分泌或轉運而在病毒複製和致病性中發揮作用。

HCV RNA基因組5’端非翻譯區含有病毒RNA複製所需的順式元件和啓動病毒蛋白多肽翻譯的內部核糖體進入位點（IRES）。由多個莖環結構、膨出環狀結構、及假結結構組成，可分為4種不同的結構域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）。結構域Ⅰ含有一個短的5’末端莖環結構，除具有提高IRES啓動的翻譯功能外，主要負責HCV RNA的複製。結構域Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ為IRES的組成部分，負責啓動HCV蛋白多肽的翻譯。結構域Ⅱ還參與病毒RNA的複製。此外，核心蛋白氨基端編碼區含有兩個莖環結構（Ⅴ和V1），參與調控IRES啓動的翻譯和HCV RNA 的複製。與其它正鏈RNA病毒一樣，HCV NS5B羧基端編碼區含有一個順式複製元件（Cis-replication element，CRE），它能與3’末端第二個莖環上的鹼基配對形成一個互吻環（圖2），CRE的核苷酸序列及其2級和3級結構均對HCV RNA複製十分重要。3’端非翻譯區含有3個獨特的區域：可變區（VR）、多聚（U/C）區段、和3’端高度保守的98個核苷酸序列（圖2）。3’端的98個核苷酸摺疊形成具有3個莖環的2級結構。實驗證明多聚（U/C）和3’端98個核苷酸對於HCV在黑猩猩體內的複製必不可少。可變區的核苷酸序列似乎還具有基因型特異性，並且對於HCV RNA在細胞內的複製非常重要，多聚（U/C）區和3’端98個核苷酸序列及其莖環結構對於HCV RNA的複製均起着關鍵性的作用。與5’端類似，3’端非翻譯區也與多種細胞蛋白質結合，其中包括多聚嘧啶結合蛋白（PTB）、糖酵解甘油醛-3-磷酸脱氫酶（GAPDH）。至於細胞蛋白如何與3’端非翻譯區序列及其2級結構相結合，如何對HCV RNA複製進行調控仍尚待進一步研究。

HCV的細胞感染週期基本上與其他正股單鏈RNA病毒類似。病毒吸附於細胞膜表面的病毒受體或輔助受體，經受體介導的胞吞作用進入細胞。在胞內體酸性環境的誘導下，病毒膜與細胞膜發生融合，致使病毒RNA被釋放到細胞漿內。然後，病毒RNA經核糖體通過內識別啓動而翻譯出一條病毒蛋白多肽，再經細胞肽酶和病毒NS2和NS3蛋白酶切割而形成單個的病毒蛋白質分子。病毒RNA和非結構蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B以及某些細胞蛋白共同在內質網膜上組裝成HCV複製複合體，催化HCV RNA由正鏈到負鏈再由負鏈到正鏈的複製，最後，新合成的HCV RNA基因組和病毒結構蛋白裝配成病毒顆粒，並從感染的細胞中釋放。現研究發現，越來越多的細胞表面蛋白與HCV的吸附及細胞進入有關，包括CD81、低密度脂蛋白受體（LDLr）、葡糖氨基葡聚糖如C-型凝集素（DC-SIGN和L-SIGN）、高密度脂蛋白受體（SR-BI）、claudin蛋白和occludin蛋白。最近的研究表明CD81、SR-BI、claudin-1和occludin可能作為HCV的受體或輔助受體介導病毒的細胞進入，但其分子機理以及其他細胞表面蛋白在病毒吸附和細胞進入中的作用有待進一步闡明。HCV RNA的複製是一個非常複雜的生物反應過程，需要多種病毒和細胞蛋白通過蛋白-RNA和蛋白-蛋白相互作用來實現。HCV RNA的複製是在附着於核周內質網膜上的病毒複製複合體中進行，此複合體由病毒RNA和非結構蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B以及對HCV RNA複製起重要作用的細胞蛋白組成。NS5B的RNA聚合酶（RdRp）在RNA複製中催化RNA的合成，純化的重組NS5B可以通過引物依賴（引物延伸）或非引物依賴（從頭合成）的方式啓動體外RNA的合成。與其他正鏈、負鏈和雙鏈RNA病毒一樣，HCV在體內以從頭合成的方式啓動RNA的複製。但是NS5B聚合酶本身缺乏模板特異性，需要與其他非結構蛋白以及細胞蛋白共同作用才具有HCV RNA複製的特異性。已經證明，所有HCV編碼的酶（NS2/3蛋白酶、NS3/4A絲氨酸蛋白酶、NS3解繩酶/核苷三磷酸酶和NS5B聚合酶）對HCV在黑猩猩體內的感染和複製均必不可少。此外，許多細胞蛋白在HCV RNA複製中起着極為重要的作用，如脂肪酸合成酶和上述提及的親環蛋白A（CypA），均可與病毒非結構蛋白結合從而對HCV RNA的複製進行調控。此外，細胞蛋白還可與HCV RNA基因組的5’和3’端非翻譯區結合而影響HCV RNA的複製。儘管越來越多的細胞蛋白被揭示對HCV RNA複製起重要作用，但其在RNA複製中的具體功能和作用機制還有待進一步研究。

如今，對HCV複製機制的研究主要是應用體外重組系統，包括在細胞內表達HCV蛋白以及HCV RNA複製子。許多研究證明亞基因組和全長基因組HCV RNA都能在人肝癌細胞系Huh7中高效複製。另外，亞基因組HCV RNA還可在人非肝細胞，如Hela和293細胞中複製。HCV RNA亦可在小鼠肝癌細胞及胚胎成纖維細胞中複製。這些研究的發現表明HCV嚴格的嗜肝性不侷限在RNA的複製上。然而，亞基因組HCV RNA在非肝細胞或小鼠肝細胞的複製僅限於少部分細胞，提示某些細胞中具有對HCV RNA複製的特異細胞因子。探明這些對HCV複製異常重要的細胞因子有助於闡明HCV複製的機制，併為抗病毒藥物的研發提供新的靶點。更為重要的是我們實驗室與國際上其他3個獨立實驗室於2005年同時建立了感染性HCV細胞培養系統，為研究病毒的細胞進入、複製及病毒顆粒裝配和釋放的分子機理奠定了基礎。我們最近的研究證明，細胞的前脂蛋白E（ApoE）對於病毒顆粒的裝配具有必不可少的作用。至於其他細胞蛋白是否也參與HCV感染、複製及病毒顆粒的裝配已成為如今一大熱門研究領域。今後對於HCV病原學的研究重點應該是闡明HCV結構蛋白在病毒RNA複製中的調控作用、HCV非結構蛋白在病毒顆粒裝配中的功能、病毒和細胞蛋白在HCV複製中的確切作用及它們結構與功能的相互關係。更為重要的是需要建立可靠的HCV複製的動物模型，以闡明導致HCV慢性感染和誘化肝細胞癌的機理，以及研發安全有效的抗病毒藥物和疫苗。