細胞培養技術

1.直接觀察活細胞的形態結構和生命活動。用於細胞學、遺傳學、免疫學、實驗醫學和腫瘤學等多種學科研究.

2.直接觀察細胞的變化可便於攝影。

3.研究細胞種類如低等到高等到人類、胚胎到成體、正常組織到腫瘤。

4.便於使用各種技術：相差、熒光、電鏡、組化、同位素標記等方法觀察和研究細胞狀況。

5.是分子生物學和基因工程學的研究對象，也是其主要的組成部分。

6.易於施用物理、化學生物的實驗研究。

7.易於提供大量生物性狀相似的實驗對象,耗資少比較經濟。

8.成為生物製品單克隆抗體生產和基因工程等的材料來源。

組織和細胞離體後獨立生存在人工的培養環境中，雖然模擬體內環境，仍有很大差異。 因而利用培養細胞做實驗時，不應視為體內細胞完全相同，把實驗結果推測體內，輕易做出與體內等同的結論。

細胞類型根據是否附於支持物上生長的特性，分為 貼附型、懸浮型。

細胞貼附在支持物表面生長，只依賴貼附才能生長的細胞叫做貼附型細胞(Anchorrage-dependent cells)這種現象與細胞分化有關。

1.成纖維型細胞：(fibroblast) 來自中胚層

特點：與體內成纖維細胞形態相似,胞體梭型或不規則三角形,中央有圓形核,胞質向外伸出2～3個長短不同的突起。細胞在生長時呈放射狀,漩渦或火焰狀走行。

起源：細胞來自中胚層間充質組織。

除真正的成纖維細胞、心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內皮細胞。

注意：細胞在培養時成為成纖維型細胞是一種慣稱,與體內細胞不同。

2.上皮型細胞(epithlium cell type) 來自外胚層。

特點：扁平不規則多角型、圓形核、細胞緊密相連成細胞增殖數目增多時,整個上皮膜隨之移動。邊緣細胞很少脱離細胞羣而單獨活動“ 拉網”現象與起源內外胚層組織有關。

組織: 皮膚表皮及其衍生物(汗腺、皮脂腺)消化道分上皮、肝、胰、肺泡上皮。

3. 遊走型細胞(wandering cell type)

特點：在支持物上散在生長,不連接成片,胞質伸出偽足或突起呈活躍的遊走或變形運動,速度快不規則, 密度大連接成片呈多角形不易與其他類型的細胞 區別。

4. 多形型細胞(polymorphic cell type)

特點： 無規律的形態，如神經細胞。

特點： 不貼附在支持物生長，胞體圓形，在培養液中生長空間大，可長時間的生長，繁殖旺盛便於做細胞代謝研究。S180肉瘤、血液裏的白細胞、K562、 HL－60。

分型的目的：

方便描述細胞在培養過程中的形態變化。培養條件好時，細胞相對穩定，可反映出起源、正常異常的區別，作為判定細胞生物學性狀指標。

強調：一般形態並不是一項可靠指標要受各方面影響。

如：反覆開關温箱、温度、C02的濃度、培養基變鹼、支原體、pH值。細胞在接種時呈三角型狀態，經培養一定時間後，細胞在傳代前已形成上皮型細胞。

培養細胞的生存環境是培養瓶、器皿或其他容器，生存空間及營養是有限的。當細胞增殖到一定密度後，分離出一部分細胞和更新營養液，使細胞更好地生存，這一過程稱之為“傳代”(passage或subculture)。

值得注意的是：每次傳代細胞在生長和增殖方面受到一定的影響。

指細胞在培養過程中持續增殖和生長的時間。一般根據細胞種類、性狀和原供體的年齡的情況而定。

如：二倍體成纖維細胞，在不凍存和反覆傳代條件下可傳30～50代，相當於150～300個細胞增殖週期，能維持一年左右的生命，細胞便開始凋亡(apoptosis)。 細胞在生存過程中經歷以下三個階段

1.原代培養期(primary culture)

組織到第一次傳代時間大約為1～4周

特點：

細胞移動活躍,但分裂不旺盛,多呈二倍體核型。

原代與體內原組織形態結構和功能活動基本相似。

各細胞的遺傳性狀互不相關，細胞相互依存性強，如果把這種稀釋分散成單細胞,在軟瓊脂培養基中進行培養,細胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降，表明細胞獨立生存性差。

2.傳代期(passage)

初代培養細胞一經傳代便稱之為細胞系(cell line)

特點：

細胞增殖旺盛，並維持二倍體核型，也叫二倍體細胞系(diploid cell line)為了保存二倍體細胞性質，細胞應在初代或傳代早期凍存為好。

一般細胞在10代以內凍存。

凍存配方：

向培養液加入保護劑二甲基亞碸(DMSO)或甘油,封入安瓶中。

存於在液氮中温度可達到－196℃，可長期儲存。如解凍後細胞復甦，仍能繼續增殖生長，細胞性狀不受影響，成為保存細胞最主要的手段。

3.衰退期

特點：細胞仍生存 增殖減慢 不增殖 輪廓增強 衰退凋亡

注意：細胞在三期中的任何一期（一般發生在傳代後期或衰退期）在某些因素影響下,如血清質量不佳、病毒污染、温度和pH不穩等,細胞可能發生自發轉化(spontaneous transformation);

細胞可能獲得永生性(immortality) 或稱為惡性性(malignancy)。細胞獲得持久性的增殖能力,這樣的細胞羣體稱為連續細胞系(continuous cell line)。而細胞獲得不死性後,細胞核型大多變成異倍體(heteroploid)接觸抑制消失。

“ 一代”指細胞接種到分離再培養的所用的時間。與細胞倍增一代不是一個含義。在細胞一代中，細胞能倍增3～6次，經歷三個階段：

1. 潛伏期(latent phase) ：

接種 經過 懸浮期(細胞質回縮,胞體呈圓球形) 貼壁。

初代培養細胞 經過 10～24小時或更多時間。

連續細胞系和癌細胞系 經過 10～30分鐘 貼附。

貼附現象是一個非常複雜和受多種因素的影響。

影響細胞貼附：底物表面不乾淨，影響細胞貼附。

利於細胞貼附：底物表面帶有陽性物質與特殊物質:

纖粘連蛋白(fibronectin FN)、

細胞表面蛋白(cell surface proteinCSP)

這些物質有的存在與細胞表面,有的來自血清。

潛伏期特點：

長短與細胞接種密度、種類、使用的培養基性質有關。

(1)細胞貼附後進入潛伏期,細胞無增殖。少見分裂相，細胞有運動活動。

(2)初代培養 細胞潛伏期約為24～96小時或更長，

連續細胞系和腫瘤細胞潛伏期約6～24小時。

(3)細胞接種密度大潛伏期短。

(4)細胞出現分裂相增多時，標誌細胞進入指數增生期。

2．指數增生期(logarithmic growth phase)：

特點：細胞增殖最旺盛階段,分裂相增多。

細胞分裂指數(mitotie index MI) ：

表示每1000個細胞中的分裂相數。

條件：分裂相數與細胞種類、培養成分、pH培養箱温度有關。

細胞分裂指數：

初代細胞：在0.1%～0.5%之間% ,

連續分裂細胞和腫瘤細胞：3 ～5%。

指數增生期是作為細胞一代活力最好的時期,是進行實驗最好和最主要的階段。

指數增生期持續3～5天，細胞數量增多後生長空間變小，細胞相互接觸可連接成片。

正常細胞：細胞相互接觸能抑制細胞運動，這種現象稱為接觸抑制(contact inhibition)。

腫瘤細胞：沒有這種現象，可作為區別正常與腫瘤細胞的標誌之一。當腫瘤細胞達到一定密度後向三維空間發展，使細胞發生堆積(piled up)。

由於細胞不斷增殖分裂，細胞數量持續增多，培養液的營養成分減少，代謝產物增多，細胞受營養的枯竭和代謝物的影響，則發生密度抑制(Density inhibition),導致細胞分裂停止。

3.停滯期(stagnate phase)

細胞量和密度達到飽和，細胞停滯增殖。表明細胞進入到停滯期,細胞數量持平，也稱為平頂期(plateau）。

特點：細胞不增殖,有代謝活動。培養液中的營養已逐漸耗盡,代謝產物積累增多,pH降低，此時需要傳代,否則細胞將會中毒,發生形態改變,細胞會從底物脱落死亡。

注意：

傳代過晚將影響下一代細胞的生長,至少要再傳 1～2代 ,通過換液淘汰死細胞和受損較輕的細胞。待細胞全部恢復後再用。

在這一點上要特別注意。