等電聚焦電泳

在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質其分佈是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特徵，這樣在鹼性區域蛋白質分子帶負電荷向陽極移動，直至某一pH位點時失去電荷而停止移動，此處介質的pH恰好等於聚焦蛋白質分子的等電點（pl）。同理，位於酸性區域的蛋白質分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點上聚焦為止。可見在該方法中，等電點是蛋白質組分的特性量度，將等電點不同的蛋白質混合物加入有pH梯度的凝膠介質中，在電場內經過一定時間後，各組分將分別聚焦在各自等電點相應的pH位置上，形成分離的蛋白質區帶。

pH梯度的組成方式有二種，一種是人工pH梯度，由於其不穩定，重複性差，現已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負極間引入等電點彼此接近的一系列兩性電解質的混合物，在正極端引入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負極端引入鹼液，如氫氧化鈉、氨水等。電泳開始前兩性電解質的混合物pH為一均值，即各段介質中的pH相等，用pH0表示。電泳開始後，混合物中pI最低的分子，帶負電荷最多，pI1為其等電點，向正極移動速度最快，當移動到正極附近的酸液界面時，pH突然下降，甚至接近或稍低於pI1，這一分子不再向前移動而停留在此區域內。由於兩性電解質具有一定的緩衝能力，使其周圍一定的區域內介質的pH保持在它的等電點範圍。pH稍高的第二種兩性電解質，其等電點為pI2，也移向正極，由於pI2＞pI1，因此定位於第一種兩性電解質之後，這樣，經過一定時間後，具有不同等電點的兩性電解質按各自的等電點依次排列，形成了從正極到負極等電點遞增，由低到高的線性pH梯度。

理想的兩性電解質載體應在pI處有足夠的緩衝能力及電導，前者保證pH梯度的穩定，後者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質應有相似的電導係數從而使整個體系的電導均勻。兩性電解質的分子量要小，易於應用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質分開，而且不應與被分離物質發生反應或使之變性。

pH梯度製作利用的兩性電解質（ampholyte，商品名為ampholine），是脂肪族多胺和多羧類的同系物，他們具有相近但不同的pKa和pI值。在外電場作用下，自然形成pH梯度。

凝膠可用：聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等。

①分辨率高，可將等電點相差0.01～0.02 pH單位的蛋白質分開；②靈敏度高，可以分離濃度很低的樣品，且重複性好；③隨電泳時間的延長，區帶越來越窄；④樣品混合液可以加在電泳系統的任何部位，通過等電聚焦作用，各組分均能聚焦到各自等電點的pH位置；⑤可以準確測定多肽、蛋白質等兩性電解質的等電點。

主要缺點：①對某些在等電點時溶解度低或可能變性的組分不適用；②由於電泳過程要求使用無鹽溶液，而有些酶和蛋白質在無鹽溶液中溶解度較低，因此可能會產生沉澱。 ^[1]