第三代測序技術

第三代測序技術原理主要分為兩大技術陣營：

第一大陣營是單分子熒光測序，代表性的技術為美國螺旋生物(Helicos)的SMS技術和美國太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMRT技術。脱氧核苷酸用熒光標記，顯微鏡可以實時記錄熒光的強度變化。當熒光標記的脱氧核苷酸被摻入DNA鏈的時候，它的熒光就同時能在DNA鏈上探測到。當它與DNA鍊形成化學鍵的時候，它的熒光基團就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標記的脱氧核苷酸不會影響DNA聚合酶的活性，並且在熒光被切除之後，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。

第二大陣營為納米孔測序，代表性的公司為英國牛津納米孔公司。新型納米孔測序法（nanopore sequencing）是採用電泳技術，藉助電泳驅動單個分子逐一通過納米孔 來實現測序的。由於納米孔的直徑非常細小，僅允許單個核酸聚合物通過，而ATCG單個鹼基的帶電性質不一樣，通過電信號的差異就能檢測出通過的鹼基類別，從而實現測序。

第一：因為在顯微鏡實時記錄DNA鏈上的熒光的時候，DNA鏈周圍的眾多的熒光標記的脱氧核苷酸形成了非常強大的熒光背景。這種強大的熒光背景使單分子的熒光探測成為不可能。Pacific Biosciences公司發明了一種直徑只有幾十納米的納米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，單分子的DNA聚合酶被固定在這個孔內。在這麼小的孔內，DNA鏈周圍的熒光標記的脱氧核苷酸有限，而且由於A，T，C，G這四種熒光標記的脱氧核苷酸非常快速地從外面進入到孔內又出去，它們形成了非常穩定的背景熒光信號。而當某一種熒光標記的脱氧核苷酸被摻入到DNA鏈時，這種特定顏色的熒光會持續一小段時間，直到新的化學鍵形成，熒光基團被DNA聚合酶切除為止。

第二：共聚焦顯微鏡實時地快速地對集成在板上的無數的納米小孔同時進行記錄。

1、它實現了DNA聚合酶內在自身的反應速度，一秒可以測10個鹼基，測序速度是化學法測序的2萬倍。

2、它實現了DNA聚合酶內在自身的延續性，一個反應就可以測非常長的序列。二代測序可以測到上百個鹼基，但是三代測序就可以測幾千個鹼基。

3、它的精度非常高，達到99.9999%。

4、直接測RNA的序列。既然DNA聚合酶能夠實時觀測，那麼以RNA為模板複製DNA的逆轉錄酶也同樣可以。RNA的直接測序，將大大降低體外逆轉錄產生的系統誤差。

5、第二個是直接測甲基化的DNA序列。實際上DNA聚合酶複製A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時間不同。根據這個不同的時間，可以判斷模板的C是否甲基化。

由於具有讀長長的特點，SMRT測序平台在基因組測序中能降低測序後的Contig數量，明顯減少後續的基因組拼接和註釋的工作量，節省大量的時間[25]。Christophern等[26]僅僅用0.5*的Pacbio RS系統長度的數據與38*的二代測序(NGS)的測序數據，對馬達加斯加的一種指猴基因組進行拼裝，大幅度提高了數據的質量和完整度，同時藉助Pacbio RS的幫助將原有的Contig數量減少了10倍。DavidA．等利用Pachio RS平台C2試劑通過全球合作幾天內就完成了從德國大腸桿菌疫情中獲得的大腸桿菌樣品以及近似菌株的測序和數據分析，最終獲得了2900bp的平均讀長以及99.998%的一致性準確度。在對霍亂病菌的研究中，第三代測序技術已初現鋒芒。研究人員對5株霍亂菌株的基因組進行了測序研究，並與其他23株霍亂弧菌的基因組進行對比。結果發現海地霍亂菌株與2002年和2008年在孟加拉國分離得到的變異霍亂弧菌ElTorO1菌株之間關係密切，而與1991年拉丁美洲霍亂分離株的關係較遠。相對NGS的優勢就是能更快獲得結果，因此該系統在鑑定新的病原體和細菌的基因組測序方面得到很廣泛的應用 ^[1]  。

SMRT技術採用的是對DNA聚合酶的工作狀態進行實時監測的方法，聚合酶合成每一個鹼基，都有一個時間段，而當模板鹼基帶有修飾時，聚合酶會慢下來，使帶有修飾的鹼基兩個相鄰的脈衝峯之間的距離和參考序列的距離之間的比值結果大於1，由此就可以推斷這個位置有修飾。甲基化研究中關於5mC和5hmC（5mC的羥基化形式）是甲基化研究中的熱點。但現有的測序方法無法區分5mC和5hmC。美國芝加哥大學利用SMRT測序技術和5hmC的選擇性化學標記方法來高通量檢測5hmC。通過聚合酶動力學提供的信息，可直接檢測到DNA甲基化，包括N6甲基腺嘌呤、5mC和5hmC，為表觀遺傳學研究打開了一條通路。

單分子測序的分辨率具有不可比擬的優勢，而且沒有PCR擴增步驟，就沒有擴增引入的鹼基錯誤，該優勢使其在特定序列的SNP檢測，稀有突變及其頻率測定中大顯身手。例如在醫學研究中，對於FLT3基因是否是急性髓細胞白血病（AML）的有效治療靶標一直存在質疑。研究人員用單分子測序分析耐藥性患者基因，意外發現耐藥性與FLT3基因下游出現的稀有新突變有關，重新證明了FLT3基因是這種最常見白血病—急性髓細胞白血病（AML）的有效治療靶標，打破了一直以來對於這一基因靶標的疑惑。憑藉PacBio平均3000bp的讀長，獲得了更多基因下游的寶貴信息，而基於單核酸分子的測序能夠檢測到低頻率（低至1%）罕見突變，正是這項成果的關鍵所在。