硝酸還原酶

真核生物中已發現三種硝酸還原酶，高等植物中最常見的一種是NADH-specific硝酸還原酶(EC1．6．6．1)。在少數幾種植物中發現了第二種，即NAD(P)H-bispecific硝酸還原酶(EC1．6．6．2)，它在歐洲白樺中以同源異構體式存在，在大豆和單子葉植物(玉米、水稻和大麥等)中以第二種同源異構體形式和NADH-specific硝酸還原酶一起存在。第三種形式為NADPH-specific(EC1．6．6．3)，存在於真菌和苔蘚中。

硝酸還原酶是同源二聚體，每個亞基分子質量約100～110kDa，包含三個功能區，從N-末端到C-末端分別是:鉬輔酶MoCo(硝酸鹽結合與降解區域)，血紅素-Fe(細胞色素b5結合域)和FAD(黃素腺苷酸二核苷酸磷酸、細胞色素b還原酶、NADH或NADPH結合域)。這三個區域是氧化還原中心，催化電子從NADP或NADPH轉移到硝酸鹽上。這三個結構和功能域通過hingeⅠ和hingeⅡ兩個鉸鏈連接起來。植物體內，hingeⅠ連接細胞色素b5結合域和鉬輔酶/二聚化區域，它包含一個保守的磷酸化絲氨酸殘基，被具有調控作用的14-3-3二聚體識別，在植物、真菌和哺乳動物細胞中這個二聚體來自一個高度保守的基因家族。在二價陽離子存在的情況下，hingeⅠ把硝酸還原酶轉換成完全無活性的複合體，使之不能行使從NADPH到硝酸鹽之間的電子轉移，從而抑制酶的活性。

硝酸鹽被特異性的硝酸鹽轉運蛋白(硝酸還原酶T)高效運輸到植物根細胞中，儲存在液泡裏，在細胞質中被硝酸還原酶降解成亞硝酸鹽。亞硝酸鹽進入根的葉綠體或非綠色組織的質體中，在6-鐵氧還蛋白的幫助下亞硝酸還原酶將其進一步還原成銨。細胞中發生的從硝酸鹽到銨的降解過程分為兩步，第一步是硝酸還原酶將硝酸鹽降解成亞硝酸鹽;第二步為亞硝酸還原酶將亞硝酸鹽降解成銨。隨後在ATP供能下，谷氨醯胺合成酶(GS)將穀氨酸和NH+4轉換成谷氨醯胺，該過程是在葉綠體、細胞質或根細胞質體中進行的，最終銨參與到氨基酸的合成。穀氨酸合成酶(GOGAT)可將谷氨醯胺和α-酮戊二酸轉換為兩分子的穀氨酸。穀氨酸合成酶有NADH-GOGAT和Fd-GOGAT兩種類型，前者主要存在於高等植物的光合細胞中，以NADH為電子供體，活性較高;後者在高等植物光合細胞和非光合細胞中均存在，以還原態的鐵氧還蛋白為電子供體，活性較低。

此外，當植物細胞中NH+4濃度較高時，NADH提供電子，NH+4還可以由存在於葉綠體和線粒體中的穀氨酸脱氫酶還原為穀氨酸。但穀氨酸脱氫酶與NH+4的親和度較低。有些氨基酸是在轉氨酶的參與下由穀氨酸和酮酸參與形成的。氨基酸構成蛋白質和各種含氮化合物，也是次生化合物的起點。這裏的所有酶和反應被稱為硝酸鹽同化途徑。

硝酸還原酶、亞硝酸還原酶與N-亞硝胺的聯繫

植物體內的硝酸鹽在硝酸還原酶和亞硝酸還原酶的作用下，通過代謝途徑轉化為亞硝酸鹽，再轉化為銨，最後被用於蛋白質的合成。土壤中硝酸鹽含量過高時，植物體內的硝酸還原酶和亞硝酸還原酶不發揮作用，從而導致硝酸鹽和亞硝酸鹽的積累。亞硝酸鹽是在葉片褐變和莖形成過程中產生的。亞硝酸鹽是亞硝基化劑的前體，亞硝基化劑與煙草生物鹼反應生成煙草特有亞硝胺(N-亞硝胺)。硝酸鹽同化途徑第二步中，亞硝酸還原酶催化亞硝酸鹽還原成銨，因此，NO－3到NO－2再到NH+4的過程會因N-亞硝胺的積累而受限。通過修飾氮同化途徑來控制亞硝酸還原酶活性，可影響細胞中亞硝酸鹽的建成 ^[1]  。

植物硝酸還原酶受到很多環境因子調節，如氮源、光、O2/CO2、pH和温度，還有些內在因素如代謝物和植物激素。研究發現，將硝酸還原酶基因連接在CaMV35S啓動子下構成組成型表達轉入煙草中，光照或者56h黑暗處理後，轉基因煙草硝酸還原酶mRNA水平高達野生型的5倍，硝酸還原酶蛋白積累，硝酸還原酶活性被激活。這些轉基因植物葉片中硝酸鹽的含量降低，但生長和代謝未受到明顯影響。類似結果顯示，硝酸還原酶或亞硝酸還原酶基因的過表達可提高mRNA水平，也提高了植物對氮的吸收，但硝酸還原酶和亞硝酸還原酶參與調控並沒有促進植物生長或提高產量。通常，硝酸鹽降解能力和植物生長之間沒有直接聯繫，比如硝酸還原酶活性低的植物與野生型植株並無顯著差異，但當硝酸還原酶活性比野生型低10%時，生長就受到影響。Hnsch等證明，轉基因植物根部硝酸還原酶活性的喪失改變了其體內糖類和被降解的含氮物的分佈，與野生型相比生長延緩。過表達硝酸還原酶的轉基因煙草，吸收硝酸鹽的速率比野生型慢，證明了穀氨酸或其他氨基酸的大量存在。Lea等研究表明，硝酸還原酶基因的翻譯後調控可強烈影響遊離氨基酸和硝酸鹽的含量。一般情況下，硝酸還原酶的反常轉錄對代謝沒有太大影響，但在翻譯後水平，相關代謝產生了明顯的變化。硝酸還原酶的組成型表達暫時推遲了乾旱引起的硝酸還原酶活性的喪失，由此CaMV35S啓動子趨動下的硝酸還原酶的表達可能促進短期缺水後氮同化獲得更快的恢復 ^[2]  。