染色質免疫共沉澱

真核生物的基因組DNA以染色質的形式存在。因此，研究蛋白質與DNA在染色質環境下的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑。染色質免疫沉澱技術（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是目前研究體內DNA與蛋白質相互作用的方法。它的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質－DNA複合物，並將其隨機切斷為一定長度範圍內的染色質小片段，然後通過免疫學方法沉澱此複合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。ChIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關係。而且，ChIP與其他方法的結合，擴大了其應用範圍：ChIP與基因芯片相結合建立的ChIP-on-chip方法已廣泛用於特定反式因子靶基因的高通量篩選；ChIP與體內足跡法相結合，用於尋找反式因子的體內結合位點；RNA-ChIP用於研究RNA在基因表達調控中的作用。由此可見，隨着ChIP的進一步完善，它必將會在基因表達調控研究中發揮越來越重要的作用。 ^[3] 

染色體免疫共沉澱是基於體內分析發展起來的方法，也稱結合位點分析法，在過去十年已經成為表觀遺傳信息研究的主要方法。這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾。ChIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關係。近年來，這種技術得到不斷的發展和完善。採用結合微陣列技術在染色體基因表達調控區域檢查染色體活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中樞神經系統紊亂等疾病的主要通路的一種非常有效的工具。 ^[4] 

在保持組蛋白和DNA聯合的同時，染色質被切成很小的片斷，通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體，將目標片段（組蛋白髮生特異標記的片段）沉澱下來。ChIP是利用抗原和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的“protein A”特異性地結合到免疫球蛋白的Fc片段的現象合用開發出來的方法（免疫磁珠結合proteinA，proteinA結合抗體Fc段，抗體結合抗原即發生特異標記的組蛋白，這裏要注意組蛋白是和DNA結合的，這樣就把目標組蛋白和DNA的複合體沉澱下來了）。再將組蛋白與DNA分離，用獲得的DNA去做PCR分析和序列測定等檢測技術，從而進一步檢測哪些基因的組蛋白髮生了修飾。 ^[5] 

在生理狀態下把細胞內的蛋白質和DNA交聯在一起，超聲波將其打碎為一定長度範圍內的染色質小片段，然後通過所要研究的目的蛋白質特異性抗體沉澱此複合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而明確蛋白與哪些基因相互作用。 ^[5] 

一般流程：

甲醛處理細胞→收集細胞，超聲破碎→加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA複合物相互結合→加入ProteinA，結合抗體-靶蛋白-DNA複合物，並沉澱→對沉澱下來的複合物進行清洗，除去一些非特異性結合→洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA複合物→解交聯，純化富集的DNA-片斷→PCR分析。 ^[6] 

具體操作流程：

第一天:

一、細胞的甲醛交聯與超聲破碎。

1.取出細胞，加入甲醛，使得甲醛的終濃度為1%。

2.37攝氏度孵育10min。

3.終止交聯。

4.吸盡培養基，用冰冷的PBS清洗細胞2次。

5.細胞刮刀收集細胞於15ml離心管中。預冷後離心收集細胞。

6.倒去上清。

7.超聲破碎。

二、除雜及抗體哺育

8.超聲破碎結束後，離心去除不溶物質。

9.在100μl的超聲破碎產物中，加入900μl ChIP Dilution Bufer 和20μl × PIC。再各加入60μl ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4°C顛轉混勻1h。

10.1h後，在4攝氏度靜置10min沉澱，700rpm離心1min。

11.取上清。各留取20μl做為input。一管中加入1μl抗體，另一管中則不加抗體。4°C顛轉過夜。

三、檢驗超聲破碎的效果

取100μl超聲破碎後產物，加入4μl 5M NaCl，65°C處理2h解交聯。分出一半用酚/氯仿抽提。

電泳檢測超聲效果。

第二天:

免疫複合物的沉澱及清洗

12.孵育過夜後，每管中加入60μl ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4°C顛轉2h。

13.4°C靜置10min後，離心除去上清。

14.清洗沉澱複合物。清洗的步驟:加入溶液，在4°C顛轉10min，4°C靜置10min沉澱，700rpm離心1min，

除去上清。

15.清洗完畢後，開始洗脱。

16.解交聯:每管中加入20μl 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M）。混勻，65°C解交聯過夜。

第三天:

一、DNA樣品的回收

17.解交聯結束後，每管加入1μl RNAaseA(MBI) ，37°C孵育1h。

18.每管加入10μl 0.5M EDTA，20μl 1M Tris.HCl（pH6.5），2μl 10mg/ml蛋白酶K。45°C處理2h。

19.DNA片段的回收-omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶於100μl ddH₂O。

二、PCR分析 ^[1] 

ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質免疫共沉澱技術（ChIP）特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，並對其進行純化與文庫構建；然後對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員通過將獲得的數百萬條序列標籤精確定位到基因組上，從而獲得全基因組範圍內與組蛋白、轉錄因子等相互作用的DNA區段信息。 ^[7] 

實際上現在染色質免疫共沉澱通常都和芯片技術結合使用，實現高通量的篩選，在DNA與蛋白質分離後，以所獲得DNA片段為探針通過芯片去篩選靶基因。 ^[8] 

ChIP與基因芯片相結合建立的ChIP-chip方法已廣泛用於特定反式因子靶基因的高通量篩選。它與DNA芯片和分子克隆技術相結合，可用於高通量的篩選已知蛋白質分析的未知DNA靶點和研究反式作用因子在整個基因組上的分佈情況。染色質免疫共沉澱技術與芯片技術相結合更有助於科學家發明疾病的有效治療方法。調控蛋白與基因組DNA結合能夠控制DNA複製和基因表達，作為細胞調節網絡中的開關，結合位點分析信息與基因表達數據相結合，將能有助於分析尋找生物標誌物（biomarker）。轉錄因子通過與核酸直接的相互作用等方式在細胞內發揮着重要的轉錄調控作用。它們通常序列特異性地結合在基因轉錄起始位點上游的啓動子區來調節該基因的轉錄。而ASB的啓動子芯片技術則是用於檢測單個轉錄因子在細胞中的某一時刻與20,000個基因啓動子相互作用的情況。通過染色質免疫共沉澱（ChIP）技術和啓動子芯片的有機結合，可以確定任何一個特定轉錄因子的靶基因羣。 ^[8] 

ChIP-chip技術對於大規模挖掘順式調控信息成績卓著，同時它可以用於胚胎幹細胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中樞神經紊亂的發生的機制。研究人員還可以利用這項技術開發一些治療方法。目前ChIP-chip技術研究主要集中於兩個領域：即轉錄因子的結合和條件特異性；組蛋白的修飾，組蛋白修飾蛋白和染色體重建。ChIP-chip 在描述轉錄因子結合動力學中的研究、染色體結構組分的分佈、在組蛋白的修飾、組蛋白修飾蛋白和染色體重建中的應用也十分廣泛。ChIP-chip 技術的優點是，可以在體內進行反應；在給定的檢驗細胞環境的模式下得到DNA相互關係的簡單影像；使用特異性修正抗體鑑定與包含有一個特異性後轉錄修正的蛋白質的相關位點；直接或者間接（通過蛋白質與蛋白質的相互作用）的鑑別基因組與蛋白質的相關位點。缺點是：需要一個特異性蛋白質抗體，有時難於獲得；為了獲得高丰度的結合片段，必須實驗演示胞內條件下靶標蛋白質的表達情況；調控蛋白質的基因的獲取可能需要限制於組織來源中。總之，ChIP-chip 技術的發展為分析活細胞或組織中DNA與蛋白質的相互關係提供了一個極為有力的工具。在未來的研究中，將對芯片的構建進行改進，提高其實用性。使用易於獲得的抗體，增加這種方法的可用性。 ^[8] 

該技術主要應用於：組蛋白的修飾研究；染色質表觀遺傳修飾研究；轉錄調控分析；藥物開發研究；有絲分裂研究；DNA損傷與凋亡分析等。 ^[9]