微生物育種

隨着PCR技術的發展和應用，1994年美國的stemmer提出了一個全新的人工分子進化技術——DNA Shuffling（又稱洗牌技術），該技術能模擬生物在數百年間發生的分子進化過程，並可在短的實驗循環中定向篩選出特定基因編碼的酶蛋白活性提高几百倍甚至上萬倍的功能性突變基因。其基本原理是將來源不同但功能相同的一組同源基因，用DNA核酸酶I進行消化 產生隨機小片段，由這些小片段組成一個文庫，使之互為引物和模板，進行PCR擴增，當一個基因拷貝片段作為另一個基因拷貝的引物時，引起模板轉換，重組因而發生，導入體內後，選擇正突變體作新一輪的體外重組。一般通過2-3次循環，課獲得產物大幅度提高的重組突變體。

對自然界中的微生物，在未經人工誘變或雜交處理的情況下進行分離和純化（見微生物的分離和純化），然後進行純培養和測定（見微生物測定法），擇優選取微生物的菌種。這種方法簡單易行，但獲得優良菌種的幾率小，一般難以滿足生產的需要。

分誘變育種和雜交育種兩種。

誘變育種

以誘發基因突變為手段的微生物育種技術。1927年，H.J. 馬勒發現X射線有增加突變率的效果；1944年，C.奧爾巴克首次發現氮芥子氣的誘變效應；隨後，人們陸續發現許多物理的（如紫外線、γ射線、快中子等）和化學的誘變因素。化學誘變因素分為3種：①誘變劑與一個或多個核酸鹼基發生化學變化，使DNA複製時鹼基置換而引起變異，如羥胺亞硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、硝基胍、亞硝基甲基脲等；②誘變劑是天然鹼基的結構類似物，在複製時參入DNA分子中引起變異，如5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤和2-氨基嘌呤等；③誘變劑在DNA分子上減少或增加1～2個鹼基，使鹼基突變點以下全部遺傳密碼的轉錄和翻譯發生錯誤，從而導致碼組移動突變體的出現，如吖啶類物質和一些氮芥衍生物（ICR）等。誘變育種操作簡便，突變率高，突變譜廣，它不僅能提高產量，改進質量，還可擴大產品品種和簡化工藝條件。如1943年從自然界分離到的青黴素產生菌的效價只有20單位/毫升，經過一系列的誘變育種後，效價已達40000單位/毫升；金黴素產生菌經誘變後，發酵液中又積累了去甲基金黴素；穀氨酸棒桿菌1299經紫外線誘變後，有的能產賴氨酸，有的能產纈氨酸，增加了產品的種類；土黴素產生菌經誘變後，選到了能減少泡沫的突變菌株，從而提高了發酵罐的利用率。誘變育種的不足是缺乏定向性。

雜交育種

不同基因型的品系或種屬間，通過交配或體細胞融合等手段形成雜種，或者是通過轉化和轉導形成重組體，再從這些雜種或重組體或是它們的後代中篩選優良菌種。通過這種方法可以分離到具有新的基因組合的重組體，也可以選出由於具有雜種優勢而生長旺盛、生物量多、適應性強以及某些酶活性提高的新品系。雜交育種的方式因實驗菌株的生殖方式不同而異，如有性雜交、準性重組、原生質體融合、轉化、轉導、雜種質粒的轉化等；但是，選擇親株、分離羣體後代的培養、擇優去劣和雜種遺傳分析的過程基本是相同的。雜交法一般指有交配反應的菌株進行交配或接合而形成雜種。這種方法適用範圍很廣，在酒類、麪包、藥用和飼料酵母的育種，鏈黴菌和青黴菌抗生素產量的提高，麴黴的酶活性增強等方面均已獲得成功。

體細胞融合是在不具性反應的品系或種屬間細胞融合和染色體重組，先用酶溶解細胞壁，再用氯化鈣-聚乙二醇處理原生質體，促使融合，獲得雜種。此法在工業微生物的菌種改良中有積極作用。

轉化和轉導首先應用於細菌，現已廣泛用於鏈黴菌和酵母菌等。隨着重組DNA技術的發展，重組質粒的構建和轉化系統的確立，已可將目的基因轉移到受體細胞內，得到能產生具有重要經濟價值的生物活性物質（如疫苗、酶等）的株系。

微生物與釀造工業、食品工業、生物製品工業等的關係非常密切，其菌株的優良與否直接關係到多種工業產品的好壞，甚至影響人們的日常生活質量，所以培育優質、高產的微生物菌株十分必要。微生物育種的目的就是要把生物合成的代謝途徑朝人們所希望的方向加以引導，或者促使細胞內發生基因的重新組合優化遺傳性狀，人為地使某些代謝產物過量積累，獲得所需要的高產、優質和低耗的菌種。作為途徑之一的誘變育種一直被廣泛應用。國內微生物育種界主要採用的仍是常規的物理及化學因子等誘變方法。此外，原生質體誘變技術已廣泛地應用於酶製劑、抗生素、氨基酸、維生素等的菌種選育中，並且取得了許多有重大應用意義的成果。

誘變育種

1.1物理誘變

1.1.1紫外照射

紫外線照射是常用的物理誘變方法之一，是誘發微生物突變的一種非常有用的工具。DNA 和RNA 的嘌呤和嘧啶最大的吸收峯在260nm，因此在260nm 的紫外輻射是最有效的致死劑。紫外輻射的作用已有多種解釋，但比較確定的作用是使DNA 分子形成嘧啶二聚體[1]。二聚體的形成會阻礙鹼基間正常配對，所以可能導致突變甚至死亡[2]。

紫外照射誘變操作簡單，經濟實惠，一般實驗室條件都可以達到，且出現正突變的幾率較高，酵母菌株的誘變大多采用這種方法。

1.1.2電離輻射

γ- 射線是電離生物學上應用最廣泛的電離射線之一，具有很高的能量，能產生電離作用,可直接或間接地改變DNA 結構。其直接效應是可以氧化脱氧核糖的鹼基，或者脱氧核糖的化學鍵和糖- 磷酸相連接的化學鍵。其間接效應是能使水或有機分子產生自由基，這些自由基可以與細胞中的溶質分子發生化學變化，導致DNA 分缺失和損傷[2]。

除γ- 射線外的電離輻射還有X- 射線、β- 射線和快中子等。電離輻射有一定的侷限性，操作要求較高，且有一定的危險性，通常用於不能使用其他誘變劑的誘變育種過程。

1.1.3離子注入

離子注入是20 世紀80 年代初興起的一項高新技術，主要用於金屬材料表面的改性。1986 年以來逐漸用於農作物育種，近年來在微生物育種中逐漸引入該技術[3]。

離子注入時，生物分子吸收能量，並且引起復雜的物理和化學上的變化，這些變化的中間體是各類活性自由基。這些自由基，可以引起其它正常生物分子的損傷，可使細胞中的染色體突變，DNA 鏈斷裂，也可使質粒DNA 造成斷裂。由於離子注入射程具有可控性，隨着微束技術和精確定位技術的發展，定位誘變將成為可能[4]。

離子注入法進行微生物誘變育種，一般實驗室條件難以達到，應用相對較少。

1.1.4 激光

激光是一種光量子流，又稱光微粒。激光輻射可以通過產生光、熱、壓力和電磁場效應的綜合應用，直接或間接地影響有機體，引起細胞染色體畸變效應、酶的激活或鈍化，以及細胞分裂和細胞代謝活動的改變。光量子對細胞內含物中的任何物質一旦發生作用，都可能導致生物有機體在細胞學和遺傳學特性上發生變異。不同種類的激光輻射生物有機體，所表現出的細胞學和遺傳學變化也不同[5]。

激光作為一種育種方法，具有操作簡單、使用安全等優點，近年來應用於微生物育種中取得不少進展。

1.1.5 微波

微波輻射屬於一種低能電磁輻射，具有較強生物效應的頻率範圍在300MHz~300GHz，對生物體具有熱效應和非熱效應。其熱效應是指它能引起生物體局部温度上升。從而引起生理生化反應；非熱效應指在微波作用下，生物體會產生非温度關聯的各種生理生化反應。在這兩種效應的綜合作用下，生物體會產生一系列突變效應[6]。

因而,微波也被用於多個領域的誘變育種，如農作物育種、禽獸育種和工業微生物育種，並取得了一定成果。

1.1.6 航天育種

航天育種，也稱空間誘變育種，是利用高空氣球、返回式衞星、飛船等航天器將作物種子、組織、器官或生命個體搭載到宇宙空間，利用宇宙空間特殊的環境使生物基因產生變異，再返回地面進行選育，培育新品種、新材料的作物育種新技術。空間環境因素主要有微重力，空間輻射，以及其它誘變因素如交變磁場，超真空環境等，這些因素交互作用導致生物系統遺傳物的損傷，使生物發生諸如突變、染色體畸變、細胞失活、發育異常等。

航天育種較其它育種方法特殊，是航天技術與微生物育種技術的有機結合，技術含量高，成本高，個體研究者或一般研究單位都難以實現，只能與航天技術相結合，由國家來完成。

1.1.7 常壓室温等離子體誘變育種

常壓低温等離子體（Atmospheric and Room Temperature Plasma）簡稱為ARTP，指能夠在大氣壓下產生温度在25-40 °C之間的、具有高活性粒子（包括處於激發態的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）濃度的等離子體射流。ARTP技術作為一種新型的物理方法，在微生物誘變育種領域有着廣闊的應用前景。

等離子體中適當劑量的活性粒子作用於微生物，能夠使微生物細胞壁/膜的結構及通透性改變，並引起基因損傷，菌株出現遺傳物質損傷後，微生物啓動SOS修復機制，其誘導產生DNA聚合酶Ⅳ和V，它們不具有3ˊ核酸外切酶校正功能，於是在DNA鏈的損傷部位即使出現不配對鹼基，複製仍能繼續前進。在此情況下允許錯配可增加存活的機會。ARTP對遺傳物質造成的損傷，多樣性較高；又SOS誘導修復本身為容錯性修復，因此，ARTP多樣性的損傷將可能在修復過程中包容於DNA鏈中，在微生物進行復制修復時，其可能帶來多樣性的錯配可能。

ARTP應用於微生物突變育種，成本低、操作方便，沒有很多物理誘變設備（如離子束注入等）所需的離子或電子加速、真空和製冷等附屬設備；ARTP對遺傳物質的損傷機制多樣，具有較高的正突變率，突變性能多樣，對於真菌、細菌、藻類等都有效果；ARTP對環境無污染，保證操作者的人身安全，無論用何種氣體放電，其均無有害氣體產生。 ^[2] 

2.1.1 烷化劑

烷化劑能與一個或幾個核酸鹼基反應，引起DNA 複製時鹼基配對的轉換而發生遺傳變異，常用的烷化劑有甲基磺酸乙酯、亞硝基胍、乙烯亞胺、硫酸二乙酯等。

甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulphonate,EMS） 是最常用的烷化劑，誘變率很高。它誘導的突變株大多數是點突變，該物質具有強烈致癌性和揮發性，可用5%硫代硫酸鈉作為終止劑和解毒劑。

N- 甲基- N'- 硝基- N- 亞硝基胍（NTG） 是一種超誘變劑，應用廣泛，但有一定毒性，操作時應該注意。在鹼性條件下，NTG 會形成重氮甲烷（CH2N2），它是引起致死和突變的主要原因。它的效應很可能是CH2N2 對DNA 的烷化作用引起的[2]。

硫酸二乙酯（DMS）也很常用，但由於毒性太強，很少使用。乙烯亞胺，生產的較少，很難買到。使用濃度0.0001%~0.1%，高度致癌性，使用時需要使用緩衝液配置。

2.1.2 鹼基類似物

鹼基類似物分子結構類似天然鹼基，可以摻入到DNA 分子中導致DNA 複製時產生錯配，mRNA 轉錄紊亂，功能蛋白重組，表型改變。該類物質毒性相對較小，但負誘變率很高，往往不易得到好的突變體。主要有5- 氟尿嘧啶（5- FU） 、5- 溴尿嘧啶（5- BU） 、6- 氯嘌呤等。程世清等[25]用5- BU 對產色素菌（分枝桿菌T17- 2- 39） 細胞進行誘變，生物量平均提高22.5%.

2．1.3 無機化合物

誘變效果一般，危險性較小。常用的有氯化鋰，白色結晶，使用時配成0.1%~0.5%的溶液，或者可以直接加到誘變固體培養基中，作用時間為30min～2d。亞硝酸易分解，所以現配現用。常用亞硝酸鈉和鹽酸製取，將亞硝酸鈉配成0.01~0.1mol/L 的濃度，使用時加入等濃度等體積的鹽酸即可。

2.1.4 其他

鹽酸羥胺，一種還原劑，作用於C 上，使G- C 變為A- T。也較常用,使用濃度為0.1%～0.5%，作用時間60min～2h。

此外，誘變時將兩種或多種誘變因子複合使用，或者重複使用同一種誘變因子，效果更佳。顧正華等[7]以穀氨酸棒桿菌ATCC- 13761 為出發菌株，經DMS 和NTG 多次誘變處理，獲得一株L- 組氨酸產生菌。

2、誘變劑

2.1 誘變劑的選擇

在選擇誘變劑時，需要注意誘變劑的專一性，即某一誘變劑或誘變處理優先使基因組的某些部分發生突變而別的部分即使有也很少發生突變。對誘變劑專一性的分子基礎不十分了解萬儘管有關的修復途徑必定對此有影響，但它們的關係並不那麼簡單，其它各種因素，包括誘變處理的環境條件也能影響突變類型。

工業遺傳學家很難正確地預言改良某一菌種時需要何種類型的分子水平的突變。因此，為了產生類型儘可能多的突變體，最適當的方法是採用幾種互補類型的誘變處理。遠紫外無疑是所有誘變劑中最為合適的，似乎可以誘導所有已知的損傷類型。採取有效、安全的預防方法也很容易。在化學誘變劑中，液體試劑比粉末試劑更易進行安全操作。的另一個不利因素是它有產生緊密連鎖的突變叢的趨勢，儘管這種效應在某些體系中能成為有利條件。最後，必須認識到可能某些特異菌系用某些誘變劑是不能被誘變的。當然這一點通過測定易檢出的突變體，如抗藥性突變體或原養型回覆突變體的誘變動力學可以相當容易地得到驗證。[8]

2.2 誘變劑的劑量

從隨機篩選的最佳效果看，誘變劑的最適劑量就是在用於篩選的存活羣體中得到最高比例的所需要的突變體，因為這會使在測定效價的階段更省力。

因此在菌株改良以前，為了決定所用誘變劑的最適劑量，併為突變性的增強技術打下基礎，聰明的做法通常是測定不同誘變劑處理不同菌種時的突變動力學。用高單位突變本身來測定最適劑量有時是不可能的，因為這種突變的檢測很困難。但如使用容易檢出的標記如耐藥標記，只要估計到方法的侷限性，還是可以提供一些有價值的資料的。[9]

3.1 在酶製劑菌種選育中的應用

酶製劑是活的有機體產生的有催化活性的蛋白質，是所有新陳代謝過程必不可少的要素。應用原生質體誘變技術對酶製劑的生產菌株進行誘變，已經獲得了許多高產菌株。

胡杰等[10 ]對滬釀（Aspergillus oryzae） 31042米麴黴的原生質體進行紫外線-氯化鋰、N-甲基- N′-硝基-N - 亞硝基胍（N - methyle - N′- nitro - N -nitrosogunidinc,NTG）複合誘變，篩選到8 株高產中性蛋白酶突變株羣，其中最高產酶活力為出發菌株的1162倍，為以後的細胞融合、基因組改組等提供了優良的候選文庫。

3．2抗生素高產菌種選育中的應用

抗生素是微生物細胞的次級代謝產物，主要採用微生物發酵法進行生物合成。由於生產菌種產量的高低受多步代謝調控的制約，高產菌株的選育也很困難。原生質體誘變作為一種誘變技術，在抗生素的高產菌種選育中已有着廣泛的應用。

朱林東等[ 11 ] 通過紫外線誘變始旋鏈黴菌（S treptom ycespristinaespiralis）的原生質體，得到了產普那黴素為1159g/L的高產突變株，比出發菌株提高10113%。

3.3 在氨基酸、生產溶劑及有機酸菌種選育中的應用

氨基酸是生物功能大分子蛋白質的基本組成單位，在食品、飼料、醫藥、化學工業、農業等行業中應用廣泛，各國都在大力發展氨基酸生產。發酵法已成為氨基酸生產的主要方法。因此選育高產菌株是氨基酸工業發展的重要方向。

生產溶劑和有機酸是微生物的初級代謝產物，原生質體誘變技術在生產溶劑和有機酸生產菌種選育中也取得了成效。

3.4 生素菌種選育中的應用

維生素是維持人和動物生命活動必需的、但不能自身合成的一類有機物質，在生長、代謝、發育過程中發揮着重要的作用。韓建榮等用激光處理青黴（Penicillium sp）PT95 的原生質體，選育到一株菌核生物量和類胡蘿蔔素含量均有顯著提高的突變株L05。該突變株的菌核生產量提高98.6%，菌核中的類胡蘿蔔素含量提高28.3%，類胡蘿蔔素產率的增加幅度達到154.0%。

3.5 蟲菌種選育中的應用

蘇雲金桿菌（B acillus thuringiensis）是從自然界中篩選出來的一大類細菌型微生物殺蟲劑，多應用於農林害蟲的防治中。王麗紅等[ 12 ] 對蘇雲金桿菌NU- 2的原生質體進行紫外線-氯化鋰複合誘變，篩選到的突變株發酵週期從44h縮短到40.3h，晶體蛋白含量提高10.03%。

近年來，隨着新的誘變源的出現，原生質體誘變技術的應用也會有新的進展。離子束作為一種新的誘變源，有其特有的作用機理[ 13 ]，使得離子束誘變具有誘變譜廣、變異幅度大、突變率高等優點，其應用也取得了很多重要的成果，特別是運用離子注入選育Vc菌株的成功，為中國的VC 行業增添了活力。離子束注入也存在一些先天性的缺點：首先為了獲得高能量的離子束，操作必須在在真空腔中完成，而抽真空的過程對微生物有很大的破壞作用；高能離子束的温度很高，需要製冷設備進行製冷，但製冷後的離子束温度也常達到600 K以上，同樣會對微生物的生存造成很大的危害；真空設備和製冷設備以及離子束髮生設備等一系列設備均很龐大，不僅成本高，而且既不便於操作，也不便於運輸。上述缺點，在一定程度上限制了離子束注入的實際應用。航天搭載的微生物菌種，能借助微重力、空間輻射、超真空等綜合空間環境因素的轉換，在較短時間裏創造其它育種方法難以獲得的罕見基因突變，以此來進行微生物育種是空間技術育種的一個重要的應用領域，利用空間技術對某些抗生素的產量提高及酶製劑研究曾有些可喜的結果。但是由於航天搭載成本高且空間有限，因此應用受到限制。常壓室温等離子（ARTP）誘變技術與其他誘變育種方法相比，呈現出突變率高、突變株多樣、可操作性強、方便快捷、安全性高等特點，顯示出ARTP在微生物誘變育種領域中良好的應用前景。 ^[3]  ARTP已成功用於真菌、放線菌、細菌、酵母、微藻等多種微生物的誘變，取得了良好的突變效果。鑑於ARTP的優勢，未來將在微生物誘變育種方面得到越來越廣泛地應用。

隨着遺傳學和分子生物學領域的飛速發展，許多新型複雜的技術被應用於菌種選育，如原生質體融合育種技術和基因工程育種技術等，但是誘變育種技術仍是提供菌株生產能力的重要有效手段。它獲得的正突變率相對較高，可以得到多種優良突變體和新的有益基因類型。另一方面，誘變育種存在一定的盲目性和隨機性,在實際應用中，研究者應根據出發菌株及實驗室條件等具體情況來選擇合適的誘變方法。本實驗室將物理因子和化學因子結合起來對多種酵母菌株進行復合誘變，均得到了理想菌株。此外，我們正在嘗試反覆採用幾種誘變因子進行多次誘變，以期得到更為理想的菌株。

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