cDNA

cDNA是指具有與某RNA鏈呈互補鹼基序列的DNA。與RNA鏈互補的單鏈DNA，以其RNA為模板，在適當引物的存在下，由依賴RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）作用而合成，並且在合成單鏈cDNA後，再用鹼處理除去與其對應的RNA以後，以單鏈cDNA為模板，由依賴DNA的DNA聚合酶或依賴RNA的DNA聚合酶作用合成雙鏈cDNA。在這種情況下，mRNA的cDNA，與原來的基因組DNA相同而且無內含子；相反地，對應於在原來基因中沒有的而在mRNA存在的3'末端的poly A序列等的核苷序列上，與外顯子序列、先導序列以及後續序列等一起反映出mRNA結構。

遺傳控制中最大的困難並不是DNA的克隆，而是需要被克隆的特異DNA片段的分離。如果以克隆基因為目的，特異DNA片段的分離將大大有助於獲得與遺傳信息同樣多的相關的基因產物，一般説這些基因產物均為蛋白質多肽，因此抗該蛋白質的抗體對於測定和沉澱蛋白質及其前體有重要用途，甚至可用於瞭解蛋白質分子量。 ^[2] 

製備互補DNA，往往需要先分離從目的基因轉錄來的mRNA.如果該基因編碼的蛋白質是細胞中的主要蛋白質，則此基因的產物是總mRNA的主要組成部分 ^[2]  。就胰島B細胞而論，此細胞含有高水平胰島素前體mRNA，後者有時可以沉澱正在翻譯的mRNA的核糖核蛋白體，如果用特異抗體結合所表達的蛋白質(抗原)，則可從沉澱的核糖體中分離出胰島素特異的mRNA，一般特異mRNA只是細胞總mRNA中的次要成分。在這種情況下，不得不以密度梯度離心，按分子量大小把總mRNA分開，然後把分離開的mRNA直接用於試管中表達蛋白質(用家兔網織細胞的溶胞產物或小麥胚芽提取物作為翻譯系統的誘導物)再用免疫沉澱或聚丙烯酰胺凝膠電泳從許多表達的蛋白中測定出目的蛋白，從而確定表達該蛋白的特異mRNA。

所有合成cDNA第一條鏈的方法都要用依賴於RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反應，主要有兩個關鍵因素，一個是mRNA模板，另一個是反轉錄酶 ^[3]  。商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒（AMV）逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒（MLV）反轉錄酶。AMV反轉錄酶包括2個具有若干種酶活性的多肽亞基，這些活性包括依賴於RNA的DNA合成，依賴於DNA的DNA合成以及對DNA-RNA雜交體的RNA部分進行內切降解（RNA酶H活性）。MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基，兼備依賴於RNA和依賴於DNA的DNA合成活性，但降解DNA—RNA雜交體中的RNA的能力較弱。且其熱穩定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的eDNA（如大於2～3kb）。AMV反轉錄酶和MI。V反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH、最適鹽濃度和最適温度各不相同．所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要的。

AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細胞mRNA分子3’端poly（A）結合的12～18個核苷酸長的oligo（dT）。

cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種：

（1）自身引導法 ^[3]  。合成的單鏈cDNA3’端能夠形成一短的髮夾結構，這就為第二鏈的合成提供了現成的引物。當第一鏈合成反應產物的DNA—RNA雜交鏈變性後利用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段或反轉錄酶合成cDNA第二鏈，最後用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環，即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1核酸酶切割髮夾結構時無一例外地將導致對應於mRNA5’端序列出現缺失和重排，因而該方法很少使用。 ^[5] 

（2）置換合成法。該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產生的DNA RNA雜交鏈不用鹼變性，而是在dNTP存在下。利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。

從而產生一系列RNA引物，使之成為合成第二鏈的引物。在大腸桿菌DNA聚合酶工的作用下合成第二鏈。該反應有3個主要優點：①非常有效；②直接利用第一鏈反應產物，無須進一步處理和純化；③不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈髮夾環。

以Riboclone M-MLV CDNA合成技術為例。

Riboclone M—MLV cDNA合成系統採用M—MLV反轉錄酶的RNase H缺失突變株取代AMV反轉錄酶，使合成的cDNA更長。該系統的第一鏈合成使用M-MLV反轉錄酶，cDNA第二鏈合成採用置換合成法，採用RNaseH和DNA聚合酶I進行置換合成，最後用T4 DNA聚合酶切去單鏈末端，方法簡便易行。其基本步驟為先合成第一鏈：

（1）取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管，加入RNA模板和適當引物，每RNA使用0.5ug引物（如使用Not I引物接頭，用0.3ug），用H₂O調整體積至15ul，70℃處理5min冷卻至室温，離心使溶液集中在管底，再依次加入：

5X第一鏈緩衝液5ul。

RNasinRNA酶抑制劑25U

M—MLV（H）反轉錄酶200U

H2O調至總體積25ul

（2）用手指輕彈管壁，吸取5ul至另一eppendorf管，加入2~5ulCi[α一³²P]dCTPdCTP（>400Ci/mmol），用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。

（3）37℃（隨機引物）或42℃（其他引物）保温1h。

（4）取出置於冰上。

（5）摻入測定的eppendorf管加入95ul 50mM EDTA終止反應，並使總體積為100ul。可取90ul進行電泳分析（先用苯酚抽提）。另10ul進行同位素摻入放射性活性測定。

（6）第一鏈合成eppendorf管可直接用於第二鏈合成。

以上25ul反應總體積中所用RNA量為1ug，如合成5ugRNA，則可按比例擴大反應體積。倒5ugRNA使用125uL總體積進行合成。

第一鏈合成後再進行第二鏈合成：

（1）取第一鏈反應液20uL，再依次加入：

10X第二鏈緩衝液20uL

DNA聚合酶123ul。

RNaseH0.8ul

H₂O加至終體積為100/uL

（2）輕輕混勻，如需進行第二鏈同位素摻入放射性活性測定，可取出10uL至另一eppendorf管，加入2～5uLCi[α一³²P]dCTP。

（3）14℃温浴2h（如需合成長於3kb的cDNA，則需延長至3～4h）。

（4）摻入測定eppendorf管中加入90ul 50mM EDTA，取10ul進行同位素摻入放射性測定．餘下的可進行電泳分析。

（5）將cDNA第二鏈合成的反應液70℃處理10min，低速離心後置於冰上。

（6）加入2uL T4 DNA聚合酶，37℃温育10min。

（7）加入10uL 200mmol/L EDTA終止反應。

（8）用等體積苯酚：氯仿抽提cDNA反應液，離心2min。

（9）水相移至另一eppendorf管，加入0.5倍體積的7.5mol/L醋酸銨（或0.1倍體積的1.5mol/L醋酸鈉，pH5.2），混勻後再加入2.5倍體積的冰冷乙醇（-20℃），-20℃放置30min後離心5min。

（10）小心丟去上清液，加入0.5mL冰冷的70%乙醇，離心2min。

（11）小心移去上清液，乾燥沉澱。

（12）沉澱溶於10～20ul TE緩衝液。

cDNA克隆（ cDNA cloing）與RNA互補的雙鏈DNA片段，而且它能攜在克隆載體中。通常用於克隆真核生物mRNA的DNA拷貝。由於cDNA持貝是一個成熟的信息分子拷貝，因此，無內含子順序。如果在其克隆的藏體中連上一個適當的活動子序，它可在任何宿主體內得以迅速表達。 ^[4]