複製鏈接
請複製以下鏈接發送給好友
https://baike.baidu.hk/item/MTT法/1814598
複製
複製成功

MTT法

鎖定
MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脱氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臢（Formazan）並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞碸（DMSO）能溶解細胞中的甲臢，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數範圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用於一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。
中文名
MTT法
外文名
MTT assay
別    名
MTT比色法
學    科
生命科學

目錄

  1. 1 簡介
  2. 2 配製方法
  3. 3 實驗步驟
  1. ▪ 貼壁細胞
  2. ▪ 懸浮細胞
  3. 4 缺點
  1. 5 注意事項

MTT法簡介

MTT法是一種檢測細胞存活和生長的方法。MTT為黃色化合物,是一種接受氫離子的染料,可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈,在琥珀酸脱氫酶和細胞色素C的作用下,外源性MT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚( Formazan)並沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞碸(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚,用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值,可間接反映活細胞數量。在一定細胞數範圍內,MT結晶形成的量與活細胞數成正比 [1]  。

MTT法配製方法

MTT法 MTT法
通常，此法中的MTT濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶於100 ml的磷酸緩衝液（PBS）或無酚紅的培養基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液裏的細菌，放4℃ 避光保存即可。在配製和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。

MTT法實驗步驟

MTT法貼壁細胞

1、收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。
2.、5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁後即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況
3.、5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心後棄去培養液，小心用PBS衝2-3遍後，再加入含MTT的培養液。
5、終止培養，小心吸去孔內培養液。
6、每孔加入150ul二甲基亞碸，置搖牀上低速振盪10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
7、同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞碸），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞碸）

MTT法懸浮細胞

1、收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將①補足的1640（無血清）培養基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養液稀釋 lg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100(儲存液100 1640）。
2、置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h後可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀OD490nm測量各孔的吸光值）
4、離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞碸，置搖牀上低速振盪10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm測量各孔的吸光值。
5、同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞碸），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞碸），每組設定3復孔

MTT法缺點

由於MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶於水，需被溶解後才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲瓚的有機溶劑對實驗者也有損害。

MTT法注意事項

MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 範圍內。
MTT一般最好現用現配，過濾後4℃避光保存兩週內有效，或配製成5mg/ml保存在-20℃長期保存，避免反覆凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管裏，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那麼多,尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。
MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的薄膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關係，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作枱上的照明燈關掉.
配製MTT時用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶 [2]  。
PBS配方：
Nacl 8g
Kcl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
調pH 7.4
定容1L
參考資料
  • 1.    徐寒梅主編；李夢瑋，羅燕平副主編；王文靜等編,抗腫瘤藥物藥理學實驗指南 符合CFDA臨牀研究申報要求的實驗方法,中國醫藥科技出版社,2015.10
  • 2.    王輝，李萬里，張昌菊主編,醫學免疫學實驗指導,世界圖書出版西安公司,2008.7