FISH技術

FISH技術原理(2張)

熒光原位雜交技術的基本原理是如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經變性—退火—復性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應，經熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析 ^[2]  。

1.FISH選用的標本可以是分裂期細胞染色體，也可以是間期細胞 ^[3]  。

2.生物素、地高辛、Dinitrophenyl （DNP）、Ami-noacetyl Fluorine（AAF）等均可用於探針標記。近年來，大片段的DNA探針（100-400 kb）已被研製出來，由於探針較長，故可將熒光物質直接標記在核苷酸上，使雜交過程進一步簡化，而且雜交信號更強 ^[3]  。

3.熒光原位雜交可以通過CCD（電荷耦合器件）相機系統或激光共聚焦掃描成像系統將攝取的信號存儲在計算機中，經過軟件特殊處理後顯示在屏幕上。使用數碼成像相機系統或CCD相機系統，灰度圖像被拍攝幾次並存儲在計算機中，接下來通過一些人造色，軟件系統接收穫得的示例圖像，經過軟件的綜合處理，最後以多色圖像顯示出來。此外，在G-帶狀染色體被75酒精或甲醇褪色後，FISH可以更清楚地識別易位 ^[3]  。

1.樣品採集

2.固定

3.製備載片

4.細菌預處理

5.第一次雜交

6.第一次洗脱

7.封片

8.檢測結果：可使用熒光顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡等進行觀察，結合相關軟件，進行數據整理及分析 ^[1]  。

熒光原位雜交技術起源於1969年，自1990年以來，FISH在方法上形成了從一種顏色到多種顏色、從中期染色體FISH到粗線染色體FISH再到纖維-FISH的發展趨勢，靈敏度及分辨率有了大幅度提高 ^[3]  。

多色熒光原位雜交（M-FISH）， “M”分別代表“Multi-color” “Multiplex”和“Multitar get”3種類型。M-FISH的最大特點是可以在單個 FISH 實驗中進行多個繁瑣的FISH實驗和多個不同基因的定位。以下5種方法是基於多色彩FISH基礎上開發的新技術：染色體描繪、比較基因組雜交、光譜染色體自動核型分析、交叉核素色帶分析及多彩色原位啓動標記 ^[3]  。

Wiegant等首先利用化學方法染色體進行線性化，再以此線性化的染色體DNA作為載體進行FISH，使FISH的分辨率顯著提高，就是最初的纖維-FISH。據一些文獻記載，逐漸改進了DNA纖維舒展延伸的方法，使DNA纖維的伸展程度有了很大的變化。DNA纖維熒光原位雜交的關鍵在於如何製備具有高分辨率且高質量的線性DNA纖維，能進行定量分析 ^[3]  。

微陣列可以在一個實驗中檢測一個細胞中數百個基因的表達（減少和增加。組織微陣列由組織微陣列區域中的500-1000個單個腫瘤組織與管狀活組織檢查組成。細胞的組織和cDNA微陣列技術的組合可以提供一種有力的體內鑑定基因的方法，可以對一些疾病及瘤的分子變化進行重要評估 ^[3]  。

熒光免疫核型分析和間期細胞遺傳學是一種將熒光免疫核型分析和原位雜交相結合的方法，可以同時顯示異種細胞羣中單個腫瘤細胞的免疫表型和一定的基因變化。FICTION具有診斷快速且可以再現的優點，適用於FISH分析前或後沒有所需以前細胞樣品的細胞學樣本。FICTION可用於分析血液腫瘤的系譜，更好地瞭解腫瘤病理組織 ^[3]  。

熒光原位雜交技術已經被應用於多個領域。

熒光原位雜交技術能夠檢測染色體結構變異，可以較容易地檢測出缺失、附加或替換的染色體 ^[3]  。將染色體或者部分具有特異性的染色體處理製作成為熒光探針，對細胞中期的染色體進行檢測．可以發現染色體會呈現不同顏色的條帶，進而可以確定基因在染色體上的準確位置，達到染色體描繪的目的．能夠用於識別染色體重組、斷裂點分佈、鑑別染色體外核物質的起源等方面 ^[1]  。

基因定位是熒光原位雜交的最基礎最成功的應用。利用熒光原位雜交靈敏、準確，並且可以一次檢測多段基因等特點，可以確定目標基因的準確位置，確定幾個基因之間的位置關係，以及基因與染色體端粒之間的關係，基因與着絲點的關係，是構建基因圖譜的基本要素。熒光原位雜交技術被廣泛地應用於基因的物理定位及基因圖譜的繪製 ^[1]  。

腫瘤已經成為現代人類死亡的主要原因之一，腫瘤的提前確診對治療有着極大的幫助。過去診斷細胞樣本中是否含有腫瘤細胞主要用巴氏染色法等一些細胞化學染色法，一些輔助診斷手段出現相比過去的方法更快捷簡單，熒光原位雜交技術就是其中之一。熒光原位雜交技術已經被應用到膀胱癌、膽道惡性腫瘤、Barrett食管及食管腺癌、宮頸癌等多種腫瘤的初期診斷中，並且效果顯著 ^[1]  。

另外，熒光原位雜交技術與其他技術的聯用，如與免疫、量子點、微流控芯等技術聯用，提高了效率，縮短了週期 ^[3]  。