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馬肝醇脱氫酶

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馬肝醇脱氫酶(Horse hepatic alcohol dehydrogenase,HLADH)是常用的脱氫酶,其底物專一性不強,因而可催化多種底物還原,應用廣,缺點是立體選擇性不高。HLADH是由兩個亞基組成的二聚體,每個亞基含有兩個鋅離子。該酶的三維空間結構已由X射線衍射法確定。
中文名
馬肝醇脱氫酶
外文名
Horse hepatic alcohol dehydrogenase
縮    寫
HLADH
本    質
脱氫酶
結    構
兩個亞基組成的二聚體
缺    點
立體選擇性不高

馬肝醇脱氫酶簡介

馬肝醇脱氫酶(Horse hepatic alcohol dehydrogenase,HLADH)是常用的脱氫酶,其底物專一性不強,因而可催化多種底物還原,應用廣,缺點是立體選擇性不高。HLADH是由兩個亞基組成的二聚體,每個亞基含有兩個鋅離子。該酶的三維空間結構已由X射線衍射法確定。
馬肝醇脱氫酶可與酵母醇脱氫酶(YADH)的一級結構差別很大,但它們的四級結構非常相似。HLADH的最大用途是還原中等大小的單環酮(四到九元環)和雙環酮,無環酮被還原時的立體選擇性低,具有空間位阻和分子結構大於萘烷的酮不宜作為該酶的底物。
圖1 圖1
具有空間位阻的籠狀多環酮能被選擇性還原。2—三環癸酮(2—twistanone)消旋體被HLADH還原後,產生外醇和未反應的對映體酮,其對映體過量率分別為e.e.90%和e.e.68%,見圖1。
一些單環酮和雙環酮消旋體已被HLADH所拆分,催化反應具有極高的對映體選擇性。O或S取代的雜環酮也是HLADH的適宜底物,例如8—位氧或硫取代的消旋體(土)—二環壬烷—3—酮能被HLADH還原拆分,見圖1。但是8—位N取代的這種環酮卻不能被拆分,這是由於含氮底物與酶分子活性中心的Zn2+形成配位鍵,而使酶喪失活性。
圖2 圖2
馬肝醇脱氫酶(HLADH)能催化消旋體2—烷基噻喃—4—酮的還原,酶使H+僅從si面進攻羰基,產生一個反式一(S)一醇和順式—(S)一醇。非對映體醇可用色譜法加以分離,然後再被氧化成光學活性的酮,從而將消旋體拆分,見圖2。
二環或多環酮分子中的橋頭碳原子不能發生消旋化而使構型保留,因此HLADH催化內消旋體順式十氫萘—2,7—二酮、反式十氫萘一2,6一二酮和無手性1,2,3,4,5,6,7,8一八氫萘—2,6—二酮還原後產生具有高度光學活性(S)一醇,產物的對映體過量率大於98%,見圖3。
圖3 圖3
HLADH還能催化具有軸手性金屬有機化合物的立體選擇性還原拆分。消旋體三羰絡(鄰甲基環戊二烯甲醛)錳金屬有機物可被對映選擇性地還原為限(R)一醇和未反應(S)一醛,它們均具有很高的光學活性,見圖4。另外,消旋體三羰絡(鄰取代苯甲醛)鉻金屬有機物也可被HLADH在pH值為7的條件下,含吐温80(Tween80)的緩衝液中催化還原拆分。36℃反應8小時,醇和醛的產率約為80%,對映體過量率為80%~90%。
圖4 圖4
為了預測HLADH催化還原反應的立體化學,人們提出了一些模型。最近發展的立方體模型(cubic—space descriptor)對手性中心遠離羰基的酮還原結果的預測更為準確,該模型認為平面環己酮的羰基氧原子與酶活性中心的Zn2+離子形成配位鍵,H+從空間位阻較小的底面向羰基發生親核進攻,見圖5 [1] 
圖5 圖5

馬肝醇脱氫酶馬肝醇脱氫酶在大腸桿菌中的表達

編碼的氨基酸序列與文獻報道的完全相同。在利用基因工程的方法表達馬肝醇脱氫酶過程中,可能是啓動子的影響,存在不表達和包涵體表達的情況,研究先後嘗試使用了pET20b(+),pET30a,pTre99a,pkk223—3等表達載體,在利用載體pkk223-3在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達時,經檢測產物有可溶性表達,並且均有氧化環己醇的活性,其中E型活性強於s型。最後,將馬肝醇脱氫酶E型和s型基因c端分別連接His tag,利用載體pkk223—3在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達,從而使馬肝醇脱氫酶表達產物可以用鎳柱進行親和純化。實驗中重組HLADH—E和HLADH—S的活性與文獻中相似,純化後的比活性高於文獻中的結果,這可能是親和純化後的酶純度高,並且親和純化的過程短,對蛋白活性的保持好的原因。 研究不但實現了馬肝醇脱氫酶的可溶性表達,還利於表達後的分離純化,為馬肝醇脱氫酶的進一步研究和應用奠定了良好的基礎,相關研究正在進行 [2] 
參考資料
  • 1.    何燕生, 梁樹堅, 鄒承魯. 醇脱氫酶和其它蛋白質光照產生新熒光物質的研究[J]. 中國科學, 1981(4):114-120.
  • 2.    韓雲波, 朱麗, 張怡軒,等. 馬肝醇脱氫酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達[J]. 生物學雜誌, 2010, 27(2):33-35.