顯微注射法

顯微注射法（microinjection）是利用管尖極細（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養的細胞中，然後藉由宿主基因組序列可能發生的重組（rearrangement）、缺失（deletion）、複製（duplication）或易位（translocation）等現象而使外源基因嵌入宿主的染色體內。

這種顯微注射術的程序，需有相當精密的顯微操作設備，製造長管尖時，需用微量吸管拉長器（micropipettepuller），注射時需有固定管尖位置的微量操作器。這種技術的長處為任何DNA在原則上均可傳入任何種類的細胞內。此法已成功運用於包括小鼠、魚、大鼠、兔子及許多大型家畜，如牛、羊、豬等基因轉殖動物。

以顯微注射法轉外源基因沒有長度上的限制，已證明數百kb之DNA片段均可以成功產製出轉基因動物。其缺點是設備精密而昂貴、操作技術需要長時間的練習，以及每次只能注射有限的細胞。這些操作中所使用的微量移液管是用毛細管拉針器(pipettepuller)來製作的，先將玻璃毛細管加熱到其熔化的温度，再將其拉制成所需的合適大小的直徑和錐形，微量移液管小頭的直徑（小至0.2微米）與纖維操縱器的高精度相關，它可以用於精準的移液。這種精確度可以為各種類型和任意大小的細胞提供亞皮克升級或0.1微米(micron)範圍內的精確的、重複性良好的細胞內和細胞旁註射。通過運用直接的水壓（壓力注射）或者不通過使用水流，而通過施加一電場來使帶電離子運動（離子電滲法），都可以獲得將微量移液管中的物質擠噴出去的效果。

最常用來生產轉基因動物的方式為：直接把重組過的 DNA 注入受精卵的原核(pronuleus) 中，也就是將從胚胎提供者的輸卵管中取得的受精卵移到倒置顯微鏡上的微量注射台上，然後利用固定吸量管 (holdingpipette) 固定住，之後注射針則依序穿過 zona pellucida，ocyte membrane 及malepronuleus membrane後，將 DNA注入，注入時可以見到原核膨大。以小鼠受精卵雄原核的顯微注射為例，顯微注射所使用的受精卵固定吸管（holdingpipette）及注射針（injectionneedle）製備很困難，除影響操作時間外，也是影響轉基因效率及基因注入後之胚胎存活及轉基因成功與否極其重要的因子。固定吸管之內、外徑分別為30、80μm是較為合適的，顯微注射針自針尖起20μm處的外徑為4μm時，可獲得良好的轉染效率。固定吸管的內徑如果太小，會導致吸力不足，對受精卵操控不易；如太大，則受精卵易受傷害，影響胚胎的存活率。顯微注射針尖如果太粗，則導致插入透明帶及原核的阻力增加，且DNA流量過多，受精卵易於裂解；太細則導致針內DNA流出速率過慢，且易阻塞，而使DNA無法順利流入原核內，影響注射效率。因此進行受精卵雄原核的顯微注射時，如何製備適用固定受精卵的吸管及顯微注射針是關乎轉基因效率極其重要的因素。