門多薩假單胞菌

利用門多薩假單胞菌NK-01 合成褐藻寡糖

利用門多薩假單胞菌NK-01發酵生產褐藻寡糖，並開發其在醫藥、食品、飼料、化工和化妝品等行業的應用，生產出大批量有重要價值的下游產品。確立褐藻寡糖的發酵工藝流程和下游分離提取工藝流程，完成門多薩假單胞菌NK-01發酵生產褐藻寡糖的結構鑑定和分子量的表徵。為以葡萄糖一步法發酵生產褐藻寡糖奠定基礎。 從土壤中分離到1株能夠合成中長鏈聚羥基脂肪酸酯(PHAMCL)的細菌, 經分類鑑定命名為Pseudomonas mendocina NK-01。對於該菌株在氮源限制的情況下, 利用葡萄糖合成的PHAMCL進行了結構分析。同時, 獲得了該菌株PHA合成酶基因phaC1, 利用大腸桿菌表達載體pBluescript SK-構建了重組載體pBSphaC1, 並在E.coli JM109中成功表達。以所構建的工程菌株進行了發酵合成。

菌落圓形凸起，透明，水滴狀，表面光滑濕潤，邊緣整齊，菌體桿狀0.5*1.0μm, 有莢膜,格蘭氏陰性。具有自生固氮能力，降解芳香烴。

研究發現門多薩假單胞菌NK-01 在菌體內積累中長鏈聚羥基脂肪酸酯(PHAMCL)的同時也能夠合成褐藻寡糖分泌到發酵液中, 其產量與培養基的碳氮比有關, 高碳氮比有利於褐藻寡糖的合成。本研究利用紫外-可見分光光度法、傅立葉紅外光譜分析、1H 和13C 核磁共振對褐藻寡糖的結構進行了分析鑑定, 發現褐藻寡糖的結構是由β-D-甘露糖醛酸、α-L-古洛糖醛酸通過β-(1→4)/ α-(1→4)鍵連接而成的無支化線性多糖, 並且在單體的2 位或3 位羥基上部分乙酰化。凝膠滲透色譜(GPC)對分子量的測定結果為2054。

褐藻寡糖是褐藻多糖的寡聚物, 是聚合度較小的褐藻多糖。褐藻多糖是由海藻和細菌合成的一種多糖, 海藻中褐藻多糖主要起骨架作用, 而細菌中褐藻多糖是細胞壁的一種成分, 抵制不良的環境[1],有些細菌則將合成的褐藻多糖分泌到細胞外。褐藻多糖是由β-D 甘露糖醛酸、α-L-古洛糖醛酸通過β-(1→4)/ α-(1→4)鍵連接而成的無支化線性多糖[1]。其中β-D 甘露糖醛酸中的C5 被差向異構化即是α-L-古洛糖醛酸。褐藻多糖中有3 種類型的鏈段 (Blockstructure), 其一是完全由β-D 甘露糖醛酸按照β-(1→4)鍵結合的M-M 型; 二是完全由α-L-古洛糖醛酸按α-(1→4)鍵結合的G-G型; 三是由β-D 甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸混合交替結合的M-G 型。來自細菌的褐藻多糖和來自海藻的褐藻多糖具有相同的基本結構, 差別僅在於細菌褐藻多糖中C2 和/或C3 羥基常常不同程度地被乙酰化, 乙酰化程度因菌株及生長條件的不同而有明顯的差異[2]。褐藻多糖及其寡聚物已廣泛應用於食品、製藥、化工等多個領域, 具有廣闊的開發前景, 如富含甘露糖醛酸的褐藻多糖和寡糖具有抗腫瘤和免疫調節等作用[3-5]。

褐藻寡糖有多種合成方法。化學合成法主要缺點是需要多重基團保護和去保護步驟, 產量低, 因而沒有實際的工業價值。用酶法制備褐藻寡糖, 多是先分離純化得到褐藻寡糖裂解酶後再製備褐藻寡糖系列產物, 但酶的分離純化比較繁瑣, 且在這一過程中酶也容易失活, 酶法合成的價格也比較昂貴。本研究採用門多薩假單胞菌NK-01 合成褐藻寡糖屬於液體發酵, 工藝簡單, 發酵週期短, 適合大規模工業化生產。

研究發現Pseudomonas mendocina NK-01 在菌體內積累中長鏈聚羥基脂肪酸酯(PHAMCL)的同時,也能夠合成褐藻寡糖分泌到發酵液中。本研究採用多種分析手段, 對褐藻寡糖的結構進行了鑑定。