金玉蘭酶製劑

隨着國家對食品安全問題的關注和部分乳製品企業2010年無抗奶目標的提出，抗生素殘留問題成為影響乳製品安全的重要因素之一。目前，青黴素作為β- 內酰胺類藥物是治療牛乳腺炎的首選藥物，是牛奶中最常見的殘留抗生素。由於國內多數乳品企業對抗生素殘留超標的牛乳採取降價收購的原則，出於經濟利益的驅動，一些不法奶站為了謀求自己的經濟利益，人為的使用一些生物製劑去降解牛乳中殘留的抗生素，生產人造“無抗奶”。2005年至今，已有數家公司公開宣稱出售分解牛乳中殘留抗生素的解抗劑。迄今為止，還沒有針對這種人造“無抗奶”的相應檢測方法、檢測標準，無法從源頭上監測、把控原奶質量。 奶製品中三聚氰胺問題出現後，檢科院按照國家局科技司的安排，對奶製品中可能的添加物進行了調查。經過前期的調研工作，初步判斷市售解抗劑的主要成分是β-內酰胺酶，它是由革蘭氏陽性細菌產生和分泌的，可選擇性分解牛奶中殘留的β- 內酰胺類抗生素。β-內酰胺酶為我國不允許使用的食品添加劑,該酶的使用掩蓋了牛奶中實際含有的抗生素。β-內酰胺酶能夠使青黴素內酰胺結構破壞而失去活性，導致青黴素、頭孢菌素等抗生素類藥物耐藥性增高，從而大大降低了人們抵抗傳染病的能力，給消費者的身體健康帶來危害。 微生物方法和理化方法均利用β-內酰胺酶能夠裂解青黴素的β-內酰胺環形成青黴噻唑酸的原理檢測乳製品中是否添加解抗劑。

微生物方法 1 材料 1.1 菌株 藤黃微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001購自國家醫學菌種保藏管理中心，在營養瓊脂上傳代培養備用。 1.2 培養基 營養瓊脂培養基、抗生素檢測用培養基Ⅱ（低PH）購自陸橋。 1.3 試劑 試驗用10U青黴素藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發公司；舒巴坦、青黴素G、 β-內酰胺酶標準品、生鮮牛乳抗生素分解劑、脱脂奶粉、生理鹽水 1.4 主要儀器 牛津杯（外徑8mm） 2 方法 2.1 預試驗 2.1.1 抗生素檢測用培養基製備 90mm培養皿鋪10ml抗生素檢測用培養基Ⅱ（含1×108CFU/ml藤黃微球菌）。 2.1.2 生鮮牛乳抗生素分解劑活性分析 將10U青黴素藥敏紙片均勻貼在抗生素檢測用培養基表面，其中3片紙上滴加20ul不同稀釋度的抗生素分解劑（500萬U/ml，50萬U/ml，5萬U/ml），同時做生理鹽水和青黴素藥敏紙片對照。37℃培養18-22小時。測量抑菌圈直徑。 將不同稀釋度的抗生素分解劑保存於4℃。10天后重複試驗。 2.1.3 青黴素G濃度的選擇 在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul含有不同濃度（0IU/ml，0.005IU/ml，0.05IU/ml，0.5IU/ml，5IU/ml）青黴素G的生理鹽水，37℃培養18-22小時。測量抑菌圈直徑，以確定青黴素G使用濃度。 2.1.4 β-內酰胺酶對菌生長的影響 在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul含有不同濃度（0U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml，50萬U/ml，75萬U/ml，125萬U/ml，250萬U/ml）β-內酰胺酶的生理鹽水，37℃培養18-22小時。觀察抑菌圈情況。 2.1.5 β-內酰胺酶對青黴素抑菌效果的影響 在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul添加有0.5ug/ml青黴素G和不同濃度β-內酰胺酶（0U/ml，4U/ml，40U/ml，200U/ml，300U/ml，400U/ml）的10%脱脂奶，37℃培養18-22小時。觀察抑菌圈情況。 將不同稀釋度的抗生素分解劑保存於4℃。10天后重複試驗。 2.1.6 脱脂奶對實驗效果的影響 使用10%（w/v）脱脂奶代替生理鹽水重複2.1.3、2.1.4、2.1.5實驗。觀察實驗結果。 2.1.7 舒巴坦濃度的選擇（未完成，實驗參數待驗證） 有實驗表明，在10%脱脂奶中添加12.5-800ug/ml舒巴坦進行測試發現，含有200ug/ml舒巴坦的脱脂奶在抗生素檢測用培養基上不產生抑菌圈；含有25ug/ml舒巴坦可有效抑制10%脱脂奶中400U/mlβ-內酰胺酶對0.5ug/ml青黴素G的分解作用。 在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul添加有不同濃度舒巴坦（0ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，400ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培養18-22小時。觀察是否產生抑菌圈，以確定舒巴坦最高可適用濃度。 在青黴素G濃度（～0.5ug/ml）和舒巴坦最高適用濃度（～200ug/ml）確定的基礎上，在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul添加有0.5ug/ml青黴素G、400U/mlβ-內酰胺酶（高於推薦使用濃度100倍）和不同濃度舒巴坦（0ug/ml，25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培養18-22小時。觀察產生抑菌圈情況，以確定舒巴坦最終適用濃度。 2.1.8 脱脂奶中β-內酰胺酶的測定（未完成，實驗參數待驗證） 在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶（添加成分見表1），37℃培養18-22小時，觀察抑菌圈情況。 表1 編號 0.5ug/ml青黴素G 400U/mlβ-內酰胺酶 25ug/ml舒巴坦 結果預測（是否產生 \ 抑菌圈） 1 + － － 有 2 + － + 有 3 + + － 無 4 + + + 有 在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶（添加成分見表1），37℃培養18-22小時，觀察抑菌圈情況。 2.1.9 β-內酰胺酶檢測限的測定（未完成） 在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul添加有0.5ug/ml青黴素、25ug/ml舒巴坦和不同濃度β-內酰胺酶（0.4U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml）的10%脱脂奶，37℃培養18-22小時，觀察抑菌圈情況。 2.2 牛奶樣品中β-內酰胺酶的測定 在每個抗生素檢測用培養基上平均放置4個牛津杯，在每個杯子中分別加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶（添加成分見表2），37℃培養18-22小時，觀察抑菌圈情況。同時做脱脂奶中β-內酰胺酶的測定。 表2 編號 0.5ug/ml青黴素G 400U/mlβ-內酰胺酶 25ug/ml舒巴坦 抑菌圈 1 + － － 有(含抗生素) 2 + － + 有 3 + + － 無(不含抗生素) 4 + + + 有 5 － － + 無 與1號比直徑差異 結果預測≤3mm 含β-內酰胺酶 ≥3mm 不含β-內酰胺酶 3 實驗結果與分析 3.1 預實驗結果與分析 3.1.1 生鮮牛乳抗生素分解劑活性結果觀察與分析 第一次實驗 10天后第二次實驗 青黴素對照 第一次實驗5萬U/ml抗生素分解劑部分分解青黴素，與青黴素對照組比較抑菌圈明顯變小；50萬U/ml抗生素分解劑可以完全分解青黴素，不產生抑菌圈。 10天后第二次實驗50萬U/ml抗生素分解劑部分分解青黴素，與青黴素對照組比較抑菌圈明顯變小。 第一次實驗和第二次實驗結果比較，抗生素分解劑活性下降至少1個數量級。 3.1.2 青黴素G濃度的選擇 0.5IU/ml青黴素產生抑菌圈約為22mm，符合實驗要求。 3.1.3 β-內酰胺酶對菌生長的影響 極高濃度β-內酰胺酶不影響菌生長。 3.1.4 β-內酰胺酶對青黴素抑菌效果的影響 第一次實驗結果 10天后第二次實驗結果 第一次實驗中，4U/mlβ-內酰胺酶即可部分分解0.5IU/ml青黴素，與對照組比較抑菌圈明顯減小。 10天后第二次實驗，200U/mlβ-內酰胺酶可部分分解0.5IU/ml青黴素，與對照組比較抑菌圈明顯減小。但4U/mlβ-內酰胺酶組產生的抑菌圈與對照組比較無明顯區別。 通過第一次實驗和第二次實驗結果比較，説明抗生素分解劑活性下降

方法1：培養皿、牛津杯、牛津杯自動放置器、培養箱、內酰胺酶測量分析儀培養皿：效價專用，內徑Φ6×7.8×10mm ，100只/盒，用於微生物培養實驗，測定不同藥物對細菌的敏感度。

牛津杯：為不鏽鋼小管，內徑6mm，外徑8mm，高10mm。管的兩端平整光滑。 同批次重量差異0.01g 牛津杯自動放置器：牛津杯自動放置器是為抗生素效價測定專用放置器，自動放置鋼管，減少人工的繁瑣操作，有4管和6管型號

內酰胺酶測量分析儀：技術參數： 測量分辨率：0.0105毫米 重複測量精度：≤0.02毫米 台間測量差異：≤0.5% 效價重複測量精度：≤0.5% 儀器特點： 1、採用CCD掃描技術及進口關鍵器件，質量穩定，自動化程序高，操作簡便。 2、智能識別鋼管位置及抑菌圈大小。 3、智能識別藥敏紙片文字並進行抑菌圈歸類統計分析。 4、可依據純水對照中(A)、(B)、(D)管產生抑菌圈直徑自動判斷結果是否成立。 5、可根據樣品中(A)、(B)管產生的抑菌圈直徑自動產生陽性或陰性報告。 6、加入無效報告自動預警功能，使報告更全面可靠。 7、可生成符合GLP/GMP要求的報告，遵循原始數據及記錄的完整性，為實驗室認證提供全面數據支持。 8、方便的文件管理功能，可以任意調取歷史數據，實現真正實驗室數字化管理。 9、全新Windows界面，易學易用，軟件可以隨標準版本升級，終生維護。 β-內酰胺酶測量分析儀（智能型）

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