蔗糖酶

糖苷酶之一。催化蔗糖水解成為果糖和葡萄糖的一種酶，廣泛存在於動植物和微生物中，主要從酵母中得到。

自1860 年Bertholet 從啤酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae 中發現了蔗糖酶以來, 它已被廣泛地進行了研究。蔗糖酶（β -D-呋喃果糖苷果糖水解酶，fructofuranoside fructohydrolase， invertase）（EC 3.2.1.26）特異地催化非還原糖中的α-呋喃果糖苷鍵水解, 具有相對專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖 , 也能催化棉子糖水解, 生成密二糖和果糖。

該酶以兩種形式存在於酵母細胞膜的外側和內側, 在細胞膜外細胞壁中的稱之為外蔗糖酶(external yeast invertase)，其活力佔蔗糖酶活力的大部分，是含有50% ~70(質量分數) 糖成分的糖蛋白；在細胞膜內側細胞質中的稱之為內蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。兩種酶的蛋白質部分均為雙亞基（二聚體）結構，2種形式的酶的氨基酸組成不同，外酶每個亞基比內酶多2種氨基酸——絲氨酸和蛋氨酸，它們的分子質量也不同，外酶約為270KD（或220KD, 與酵母的來源有關），內酶約為135KD。儘管這兩種酶在組成上有較大的差別，但其底物專一性和動力學性質仍十分相似，但由於內酶含量很少，極難提取。

蔗糖在蔗糖酶的催化下．水解為D-葡萄糖和D-果糖兩種還原糖。蔗糖酶在植物的運輸貯藏、碳水化合物代謝中發揮主要作用．並在滲透調節、抗逆性生長繁殖、以及信號傳導方面也發揮着重要的作用。 ^[1] 

根據植物中蔗糖酶所處亞細胞位置，蔗糖酶可分為液胞型蔗糖酶、細胞質型蔗糖酶和細胞壁型蔗糖酶。前兩者又統稱為胞內蔗糖酶，細胞壁型蔗糖酶又被稱為胞外蔗糖酶。不同的蔗糖酶進行反應所需的最適pH 值也有所不同，由此蔗糖酶又可分為酸性蔗糖酶和中性/鹼性蔗糖酶。液胞型蔗糖酶和細胞壁型蔗糖酶在pH4 .5 至5 .0 時催化效率最高，因此也稱為酸性蔗糖酶。細胞質型蔗糖酶水解蔗糖的最適pH 值為中性或略微偏鹼性，因此稱為中性/鹼性蔗糖酶。而根據其溶解性，蔗糖酶又可分為可溶性蔗糖酶（包括液胞型蔗糖酶和細胞質型蔗糖酶）與非溶性蔗糖酶（細胞壁型蔗糖酶）。 ^[2] 

酵母離心(8 000 r/min)15 min後收集菌體。將收集到的菌體用蒸餾水洗滌，離心，再洗滌，重複數次，直到菌體呈白色，傾出上清液，將不含雜質的乾淨的酵母保存待用。 ^[1] 

準確稱取離心分離後的酵母10 g，加入60 mL 0．5 mmol/L的SDS溶液溶解，在pH值為5．5、50℃水浴中加熱12 h後取出，4℃、10 000 r/min離心20 min．上清液即為粗製酶液。4℃保存。 ^[1] 

以葡萄糖含量為橫座標。以吸光度為縱座標，繪製標準曲線。 ^[1] 

以蛋白質含量為橫座標。以吸光度為縱座標。繪製標準曲線． ^[1] 

稀釋酶液0．5 mL．加入0．3 mL pH值為4．6、0．1 mol/L的NaAc—HAc緩衝液．0．2 mL 0．1 mol/L的蔗糖溶液．37℃準確反應15rain後．加0．125 mL l mol/L的NaOH溶液中止反應。用DNS法在540 nm波長下測定形成的還原糖量。在該條件下。蔗糖酶液1 min轉化底物蔗糖生成1g葡萄糖定義為1個活力單位。 ^[1] 

在所提粗製酶液中加入乙醇使其質量分數達30%，4℃放置過夜，4℃、10 000 r/min離心15 min．取上清液．追加乙醇使其質量分數達50%，4℃放置1 h，4℃、11 000 r/min離心15 min．棄上清液．沉澱用雙蒸水溶解．4℃保存。經SDS抽提法提取．質量分數50%的乙醇沉澱所得的酶液用透析法(pH值為7.0的0.05 mol/L%s—HCI緩衝液)充分透析。所得透析液4℃保存。 ^[1] 

工藝條件優化：在單因素試驗的基礎上。選取SDS摩爾濃度、pH值、提取温度、提取時間4個條件，考察其對酵母蔗糖酶抽提效果的影響．採用4因素3水平正交表L₉3⁴。做正交試驗。 ^[1] 

採用O一瓊脂糖凝膠FF陰離子交換柱層析純化粗酶液。將SDS抽提法提取出的蔗糖酶活性高的粗製酶液經質量分數50%的乙醇沉澱，溶解透析後，過Q-瓊脂糖凝膠FF陰離子交換柱(用pH值為7．0、0．05 mol/L Tris-HCl緩衝液充分平衡)。用0～1 mol/L、60 min線性梯度的NaCI溶液(內含pH值為7．0、0．05 mol/L%s-HCI緩衝液)洗脱。體積流量為0．5 mL/min，每管收集mL。測定各管洗脱液的蔗糖酶活性與蛋白質含量，合併蔗糖酶活力高的若干管流出液。流出液經過透析脱鹽,真空乾燥後即為純化的酵母蔗糖酶。 ^[1]