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蔗糖酶
鎖定
- 中文名
- 蔗糖酶
- 又 稱
- “轉化酶”
- 最適温度
- 45℃~50℃
- 最適ph
- 4.0~4.5
目錄
- ▪ 酵母提純
- ▪ 粗酶液的製備
- ▪ 葡萄糖標準曲線的制定
- ▪ 蛋白質標準曲線的制定
- ▪ 蔗糖酶活性的測定
- ▪ 粗酶的乙醇初步分離
- ▪ SDS抽提法提取啤酒酵母中蔗糖酶
- ▪ 蔗糖酶的純化
蔗糖酶簡介
自1860 年Bertholet 從啤酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae 中發現了蔗糖酶以來, 它已被廣泛地進行了研究。蔗糖酶(β -D-呋喃果糖苷果糖水解酶,fructofuranoside fructohydrolase, invertase)(EC 3.2.1.26)特異地催化非還原糖中的α-呋喃果糖苷鍵水解, 具有相對專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖 , 也能催化棉子糖水解, 生成密二糖和果糖。
該酶以兩種形式存在於酵母細胞膜的外側和內側, 在細胞膜外細胞壁中的稱之為外蔗糖酶(external yeast invertase),其活力佔蔗糖酶活力的大部分,是含有50% ~70(質量分數) 糖成分的糖蛋白;在細胞膜內側細胞質中的稱之為內蔗糖酶(internal yeast invertase),含有少量的糖。兩種酶的蛋白質部分均為雙亞基(二聚體)結構,2種形式的酶的氨基酸組成不同,外酶每個亞基比內酶多2種氨基酸——絲氨酸和蛋氨酸,它們的分子質量也不同,外酶約為270KD(或220KD, 與酵母的來源有關),內酶約為135KD。儘管這兩種酶在組成上有較大的差別,但其底物專一性和動力學性質仍十分相似,但由於內酶含量很少,極難提取。
蔗糖酶作用
蔗糖在蔗糖酶的催化下.水解為D-葡萄糖和D-果糖兩種還原糖。蔗糖酶在植物的運輸貯藏、碳水化合物代謝中發揮主要作用.並在滲透調節、抗逆性生長繁殖、以及信號傳導方面也發揮着重要的作用。
[1]
蔗糖酶植物中蔗糖酶的分類
根據植物中蔗糖酶所處亞細胞位置,蔗糖酶可分為液胞型蔗糖酶、細胞質型蔗糖酶和細胞壁型蔗糖酶。前兩者又統稱為胞內蔗糖酶,細胞壁型蔗糖酶又被稱為胞外蔗糖酶。不同的蔗糖酶進行反應所需的最適pH 值也有所不同,由此蔗糖酶又可分為酸性蔗糖酶和中性/鹼性蔗糖酶。液胞型蔗糖酶和細胞壁型蔗糖酶在pH4 .5 至5 .0 時催化效率最高,因此也稱為酸性蔗糖酶。細胞質型蔗糖酶水解蔗糖的最適pH 值為中性或略微偏鹼性,因此稱為中性/鹼性蔗糖酶。而根據其溶解性,蔗糖酶又可分為可溶性蔗糖酶(包括液胞型蔗糖酶和細胞質型蔗糖酶)與非溶性蔗糖酶(細胞壁型蔗糖酶)。
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蔗糖酶提取方法
蔗糖酶酵母提純
蔗糖酶粗酶液的製備
準確稱取離心分離後的酵母10 g,加入60 mL 0.5 mmol/L的SDS溶液溶解,在pH值為5.5、50℃水浴中加熱12 h後取出,4℃、10 000 r/min離心20 min.上清液即為粗製酶液。4℃保存。
[1]
蔗糖酶葡萄糖標準曲線的制定
蔗糖酶蛋白質標準曲線的制定
蔗糖酶蔗糖酶活性的測定
稀釋酶液0.5 mL.加入0.3 mL pH值為4.6、0.1 mol/L的NaAc—HAc緩衝液.0.2 mL 0.1 mol/L的蔗糖溶液.37℃準確反應15rain後.加0.125 mL l mol/L的NaOH溶液中止反應。用DNS法在540 nm波長下測定形成的還原糖量。在該條件下。蔗糖酶液1 min轉化底物蔗糖生成1g葡萄糖定義為1個活力單位。
[1]
蔗糖酶粗酶的乙醇初步分離
在所提粗製酶液中加入乙醇使其質量分數達30%,4℃放置過夜,4℃、10 000 r/min離心15 min.取上清液.追加乙醇使其質量分數達50%,4℃放置1 h,4℃、11 000 r/min離心15 min.棄上清液.沉澱用雙蒸水溶解.4℃保存。經SDS抽提法提取.質量分數50%的乙醇沉澱所得的酶液用透析法(pH值為7.0的0.05 mol/L%s—HCI緩衝液)充分透析。所得透析液4℃保存。
[1]
蔗糖酶SDS抽提法提取啤酒酵母中蔗糖酶
蔗糖酶蔗糖酶的純化
採用O一瓊脂糖凝膠FF陰離子交換柱層析純化粗酶液。將SDS抽提法提取出的蔗糖酶活性高的粗製酶液經質量分數50%的乙醇沉澱,溶解透析後,過Q-瓊脂糖凝膠FF陰離子交換柱(用pH值為7.0、0.05 mol/L Tris-HCl緩衝液充分平衡)。用0~1 mol/L、60 min線性梯度的NaCI溶液(內含pH值為7.0、0.05 mol/L%s-HCI緩衝液)洗脱。體積流量為0.5 mL/min,每管收集mL。測定各管洗脱液的蔗糖酶活性與蛋白質含量,合併蔗糖酶活力高的若干管流出液。流出液經過透析脱鹽,真空乾燥後即為純化的酵母蔗糖酶。
[1]
- 參考資料
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- 1. 蔗糖酶的提取工藝及性質研究 .萬方數據[引用日期2019-08-11]
- 2. 植物中蔗糖酶的研究進展 .萬方數據[引用日期2019-08-11]